SMPD1基因多态性与帕金森病发病关系的研究

熊小琴,张琳静,陈元东

(黄州区人民医院：1.检验科;2.肿瘤内科，湖北黄冈 438000)

帕金森病(PD)系指黑质和黑质-纹状体通路变性所引发的一种锥体外系疾病，好发于老年人，以静止性震颤、行动迟缓、姿势不稳及肌强直等为主要临床表现，目前对PD发病机制仍未完全明确，普遍认为与遗传、环境及衰老等因素有关[1]；近来有研究证实PD发病与一些基因突变密切相关，目前国内外学者已克隆出约18个PD致病基因，其中SMPD1基因被证实在PD发病中起到一定作用[2-3]，研究报道SMPD1基因突变最早出现在尼曼-匹克病中，尼曼-匹克病是一种隐性溶酶体贮积病[4]，而国外学者研究已证实SMPD1基因突变会导致溶酶体功能丧失，引发体内α突触核蛋白聚合及路易小体沉积，从而导致PD发病[5]。然而，目前国内有关SMPD1基因多态性与PD发病的关系尚不完全明确，本文比较PD患者及体检健康者SMPD1基因多态性，旨在探究SMPD1基因多态性在PD疾病诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年6月至2019年1月本院神经内科收治的216例PD患者(PD组)和同期在本院体检的216例体检健康者(健康组)作为研究对象，PD患者入选标准：(1)符合英国BrainBank标准[6]有关PD诊断标准；(2)排除有PD家族病史；(3)本研究获得入选PD患者及健康体检者知情同意；(4)年龄35～85岁。排除标准：(1)继发性PD患者；(2)合并有脑血管疾病或其他全身严重疾病；(3)其他椎体外系疾病或神经系统疾病；(4)健康组既往无PD家族史。PD组216例，男116例，女100例，年龄35～84岁，平均(59.68±4.26)岁，病程1～12年，平均病程(5.26±1.03)年；健康组中男性115例，女性101例，年龄36～85岁，平均(60.08±4.19)岁，PD组和健康组性别、年龄基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。PD组和健康组都来自同一地区且均为汉族。

1.2方法

1.2.1DNA提取 纳入受试者均采集2 mL肘静脉血，采用血液基因组DNA提取试剂盒对全血基因组的DNA进行提取，并溶于50～100 μL的无菌双氧水中，采用超微量分光光度计检测DNA的纯度及浓度，保存于-20 ℃冰箱待测。

1.2.2SMPD1基因多态性分析 其中PD组患者采用PCR扩增及DNA测序，PCR扩增条件及具体操作步骤参照文献[7]设计SMPD1基因引物序列，引物序列：(1)SMPD1-1F的引物序列：CCG AGA GAT CAG CTG TCA GA，碱基数20；(2)SMPD1-1R的引物序列：TAG ATG CCA CCC TCT CCA TC，碱基数20；(3)SMPD1-2F的引物序列：GTT ACA GGG CAA TAT CTG GAA G，碱基数22；(4)SMPD1-2R的引物序列：ACA CCA TAT CAA AAG GGC CG，碱基数20；(5)SMPD1-3F的引物序列：ACT GTG AGC TCC TTG CAG GT，碱基数20；(6)SMPD1-3R的引物序列：TGC TCA AGG GAA TTT TCA GC，碱基数20；(7)SMPD1-4F的引物序列：GGG GAG GCT CCT CAC TAG AA，碱基数20；(8)SMPD1-4R的引物序列：AGC TCC AGG AAA GGA GAA GG，碱基数20；PCR反应体系共包含25 μL，1 μL Taq DNA聚合酶，1 μL DNA模板(30 ng/μL)，上下游引物各0.5 μL，2.5 μL 10×PCR缓冲液(含有MgCl2)和15 μL 2.5 mmol/L dNTP，无菌双蒸馏水补足至30 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共15个循环；94 ℃ 20 s、51 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共循环25次；72 ℃ 7 min，4 ℃保持。取PCR产物及负载染料混匀，行1%琼脂糖凝胶电泳，D100标志物为标准对照，在紫外分光光度计明确扩增产物质量，将质量符合要求的未纯化PCR产物，引物合成和测序都由北京大华大基因研究中心有限公司完成。健康组受试者在PCR扩增产物中加入AlwNI内切酶，在37 ℃酶切过夜，采用2.5%琼脂糖凝胶电泳将酶切产物分开，采用EB染色后于紫外灯下进行观察和分析。

1.2.3基因序列对比及生物信息学分析 在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站中利用Blast软件进行比对，参照对比结果判断基因是否存在突变。生物信息学分析在SIFT、IMutant2.0及MUpro网站中进行，分析SMPD1基因上新的突变点对其编码溶酶体酶SMase稳定性的影响。运用Mutation Taster及PolyPhen2检测突变点的致病性。

1.2.4Hardy-Weinberg遗传平衡定律吻合度检验 温伯格定律系指在一个不发生基因突变、人口迁移和自然选择的，无限大的且相互交配的群体当中，基因频率和基因型频率将保持不变，是群体遗传学中重要原理之一，解释了生物繁殖如何影响群体基因及基因型频率。

1.3统计学处理 采用SPSS20.0对研究数据进行分析和处理，计数资料采取率(%)表示，采用χ2检验验证两组受试者是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，同时检验PD组与健康组等位基因不同基因型频率分布差异，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组基因的Hardy-Weinberg遗传平衡定律吻合度检验 PD组基因型与健康组基因型均符合Hardy-Weinberg定律。

2.2SMPD1各基因位点在PD组和健康组中的最小等位基因频率分布 研究发现在PD组和健康组均发现4个已知的多态位点(p.A36V、p.D212D、p.P332R、p.G508R)，仅rs1050239位点中，两组等位基因频率比较差异有统计学意义(OR=1.270，95%CI：1.028～1.572，P=0.000)，见表1。

表1 SMPD1各基因位点在PD组和健康组中的最小等位基因频率分布

2.3各多态位点基因型频率及等位基因频率在两组中分布检测结果 rs1050228位点两组均有TT、CT、CC这3种基因，PD组TT、CT、CC基因频率、等位基因T、C频率(分别为73.15%、5.56%、21.30%、76.07%、23.93%)与健康组(分别为72.22%、6.02%、21.76%、78.03%、21.97%)相比较差异均无统计学意义(P>0.05)；rs7951904位点的CC、CT基因频率、等位基因C、T频率(分别为99.07%、0.93%、99.64%、0.36%)与健康组(分别为99.54%、0.46%、99.81%、0.19% )比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；rs202081954位点的CC、CG基因频率、等位基因C、G频率(分别为99.07%、0.93%、99.64%、0.36%)与健康组(分别为99.54%、0.46%、99.81%、0.19% )比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；rs1050239位点的等位基因G、A频率(分别为81.43%、18.57%)与健康组(分别为91.62%、8.38%)比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、3。各多态性位点DNA测序图见图1～4。

表2 多态位点基因型频率在两组中分布检测结果

表3 各多态位点等位基因频率在两组中分布检测结果

续表3 各多态位点等位基因频率在两组中分布检测结果

注：A为基因突变点TT、B为基因突变点CC、C为基因突变点CT，箭头所示均为突变位点

图1rs1050228多态性位点DNA测序图

注：A为突变位点CC、B为突变位点CT、箭头所示均为突变位点

图2rs7951904多态性位点DNA测序图

注：A为突变位点CC、B为突变位点CG

图3rs202081954多态性位点DNA测序图

2.4缬氨酸重复次数多态分析 研究发现PD组和健康组均发现缬氨酸重复次数的多态。发现PD组缬氨酸重复次数分布概率与健康组相比较，差异有统计学意义(χ2=25.264，P<0.05)，见表4。缬氨酸重复次数的多态见图5。

注：A为突变位点GG、B为突变位点AA、C为突变位点AG

图4rs1050239多态性位点DNA测序图

表4 缬氨酸重复多态在PD组和健康组的分布情况[n(%)]

注：A表示n=5(c.107-118deITGCTGGCGCTGG)、B表示n=6(c.108-113delGCTGGC)、C表示n=7、D表示n=9(c.143-144insGC TGGCGCTGGC)

图5缬氨酸重复次数的多态

3 讨 论

黑质致密部多巴胺能神经元变性、脱失及细胞内泛素、α突触核蛋白为主要成分路易小体形成等是PD主要病理学特征，到目前为止PD病因及发病机制尚未完全明确，国内外不少学者研究证实许多易感基因通过不同路径损害细胞新陈代谢从而导致PD发病风险明显升高[8-9]，细胞溶酶体自我吞噬通路是PD发病机制中一种重要的途径，有研究指出SMPD1参与了神经酰胺产生，其表达缺陷会引发自噬溶酶体功能障碍，与溶酶体贮积症密切相关，提示SMPD1可能对PD诊断有一定价值[10]；马艳等[11]学者研究证实原发性PD患者AMPD1基因存在p.A402T位点突变，并且这一位点突变会增加PD发病风险；FOO等[12]学者研究从198名受试者的序列中，发现了4种罕见的SMPD1(p.p332r、p.y500h、p.p533l和p.r591c)突变体，并且这些突变体只出现在PD患者中，并未在对照组受试者中出现。

一直以来临床对PD诊断主要依据患者临床症状，尚缺乏客观的诊断PD的实验室诊断依据，而SMPD1在PD发病中有一定作用，考虑SMPD1基因多态性可能在PD诊断中有一定价值。SMPD1主要位于11号染色体上，其蛋白产物为酸性鞘磷脂酶，为一种溶酶体酶(可产生神经酰胺)，SMPD1基因突变后其产物活性明显降低，引发溶酶体底物积聚，中枢神经系统及其他器官细胞功能丧失[13]。本研究对216例PD患者及216例健康体检者的SMPD1基因进行了测序，两组均检出4个已知单核苷酸多态(SNP)及缬氨酸重复次数多态，4个SNP中p.A36V、p.P332R、p.G508R 3个是错义的，p.D212D为同义，并发现PD组和健康组p.G508R等位基因频率比较，差异有统计学意义(OR=1.270，95%CI：1.028～1.572，P=0.000)，此外PD组缬氨酸重复次数分布概率与健康组相比较差异有统计学意义，尤其是当缬氨酸重复次数<7时PD发病风险更高。SMPD1基因全长共4 685 bp，含有6个外显子和5个内含子，编码产物由629个氨基酸组成的鞘磷脂酸性二酯酶1，属于一种溶酶体酶，其可裂解鞘磷脂胆碱磷酸头基，产物神经酰胺在压力作用下作为第二信使从而启动凋亡反应，促进PD病理发展[14]，此外以往有研究在NPD患者中同样发现了缬氨酸重复次数的多态[15]，并且缬氨酸序列位于酸性鞘磷脂酶的疏水核心区域，而本研究初步证实了SMPD1基因多态性在PD和健康者中比较差异有统计学意义(P<0.05)，SMPD1基因多态性在PD诊断中有积极作用，与李芳[16]学者的研究报道的观点大体上相符。

本研究中共检出4种已知的SMPD1基因位点，其中p.G508R基因及缬氨酸重复次数<7可作为预测PD是否发生的有效指标，为PD的实验室诊断提供可靠依据。

4 结 论

本文通过对SMPD1基因多态性与PD发病关系的研究，初步明确了SMPD1基因突变型p.G508R及缬氨酸<7个重复多态在PD发病中的重要作用，为PD临床诊治提供更多的决策支持，为PD患者解除疾病困扰。