agrB/D/C对Agr系统活性及金黄色葡萄球菌毒力的影响

王海连， 姜北， 喻胜鹏， 黎庶， 胡晓梅， 谭利

(1.清华大学 玉泉医院 保健科， 北京 100049； 2.陆军军医大学 西南医院 烧伤科， 重庆 400038； 3.陆军军医大学 西南医院 骨科， 重庆 400038； 4.陆军军医大学 微生物学教研室, 重庆 400038)

金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)既可以作为共生体存在于人体皮肤和黏膜中,也可以在血液和各种组织中存活，引起各种疾病如化脓性感染、食物中毒、毒性休克综合征、败血症等感染性疾病，被认为是全球医院和社区获得性感染的主要原因之一，亟须开发新的控制策略[1-3].金葡菌可产生大量毒力因子参与致病，比如血浆凝固酶、杀白细胞素(panton-val-entine leukocidin, PVL)、葡萄球菌溶血素、 肠毒素、毒性休克综合征毒素、表皮溶解毒素等[4-5].其中许多毒力因子受双组分信号系统的调控[6].金葡菌中比较重要的双组分信号系统包括Agr,SaeRS,ArlRS,VraSR等[6-7].其中Agr群体感应系统是重要的双组分系统，调节多种毒力基因的表达[8-9].金葡菌Agr系统由RNA Ⅱ和RNA Ⅲ组成，分别由P2和P3启动子控制转录.其中，RNA Ⅱ操纵子由agrA、agrB、agrC、agrD4个基因组成.当Agr系统活化时，agrD基因编码的前体多肽经AgrB蛋白的修饰和酶解作用转化成自诱导肽(autoinducing peptide，AIP)，并在AgrB蛋白辅助下分泌到胞外.当AIP分子达到临界水平时能与膜上的AgrC受体蛋白相互作用，使得AgrC蛋白活化，发挥组氨酸激酶活性，催化反应调节蛋白AgrA发生磷酸化，磷酸化的AgrA蛋白结合于靶基因启动子区域的特定位点，进而调控RNAⅡ、RNAⅢ操纵子及靶基因的转录与表达[10].

Agr系统通过将AgrA直接结合到PSM启动子区域，调控PSM的表达[11-12].此外，也通过调节RNA III控制多种毒力基因的表达.Agr系统通过与目标基因群直接碱基配对，或间接控制调控转录调控因子，如Rot、SarT和SarS，上调或下调毒力基因表达[13].Agr系统是金葡菌重要的转录调控因子.多年的研究，人们对于Agr系统的组成、功能活性及基因调控机制均有一定的了解.但从AgrB、AgrD、AgrC蛋白的角度研究其对金葡菌Agr系统基因调控功能的影响尚未有报道，故本课题将研究Agr系统及其调控机制以及对金葡菌致病作用的影响等.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细菌

大肠埃希菌DH5α为本实验室保存， 温度敏感性质粒pBT2用于构建敲除载体，可在大肠埃希菌和金葡菌中复制.金葡菌 Newman购自中国菌种保藏中心，金葡菌RN4220为限制性内切酶缺陷菌株，可对来自大肠埃希菌的质粒pBT2进行修饰.

1.1.2 主要试剂和实验仪器

Taq DNA聚合酶，氯霉素(chloramphenicol，Chl)和氨苄(ampicillin，Amp)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；PrimeSTAR高保真聚合酶购自 TaKaRa 公司；胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Tryptone soya broth， TSB)、 限制性内切酶购自Thermo Scientific 公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自 Promega 公司；溶葡菌素购自Sigma公司.

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计

以金葡菌Newman的基因组序列为模板，距离agrB/D/C基因上下游各1 000 bp左右设计同源左右臂引物对(引物名称见表1)，并引入相应的酶切位点(表1下划线部分).在载体pBT2上设计一条引物pBT2-Hind III用于敲除株单交换鉴定，在agrB/D/CNewman基因左臂外侧及右臂外侧各设计1条引物用于敲除株双交换鉴定.实时荧光定量PCR引物根据Newman基因组中各基因序列设计，设计好的引物交由重庆擎科兴业生物技术有限公司完成.敲除株构建各引物序列详见表1.

表1 PCR引物及序列Table 1 PCR primers and sequences

1.2.2ΔagrB/D/C/Newman敲除株的构建

以金葡菌Newman基因组为模板，以agrB/D/Cup引物对和agrB/D/Cdown引物对，PCR扩增agrB/D/C同源左右臂片段，用限制性内切酶处理后，在T4 DNA连接酶的作用下克隆入穿梭质粒pBT2，转化大肠埃希菌DH5α, 构建敲除载体(pBT2∷agrB/D/C).阳性质粒经电穿孔转化金葡菌RN4220进行修饰.阳性转化子经测序验证无误后，电转化金葡菌Newman感受态.30℃孵箱过夜培养后，按1∶100体积比接种于TSB 氯霉素培养基中.42 ℃过夜培养后将菌液用三线法划TSB氯霉素平板再次于42 ℃孵箱培养.随机挑取单菌落过夜培养后抽提基因组，PCR扩增筛选单交换敲除株.按1∶100体积比接种于TSB液体培养基中于25 ℃诱导双交换.挑单菌落分别接种于无抗TSB和10 μg/mL氯霉素抗性TSB平板，37 ℃孵箱培养.PCR扩增筛选双交换敲除株.

1.2.3 生物学特性分析

37 ℃过夜培养金葡菌Newman野生株和ΔagrB/D/CNewman敲除株, 将过夜菌按1∶100体积比转种体积2 mL新鲜TSB液体培养基置于37 ℃再次振摇培养过夜.

用无菌TSB按1∶1 000体积比稀释菌液，取10 μL菌液滴加血平板，置于37 ℃孵箱过夜培养；取出血平板放于冰箱24 h后观察溶血现象.另取野生株和敲除株过夜培养菌各10 μL 滴于方形平皿各3个重复，过夜培养观察色素形成；采用结晶紫染色法测定生物膜形成能力，离心收集过夜培养菌，以TSB(含体积分数1%的glucose和体积分数2%的Nacl)稀释至1.0×1010CFU/L，以每孔200 μL加入96孔版，37 ℃孵育24 h，用质量分数为1%的结晶紫染色，然后每孔加入体积分数为30%的冰醋酸溶解，测量492 nm处光密度值.

1.2.4 SDS-PAGE分析

37 ℃过夜培养金葡菌Newman野生株和ΔagrB/D/CNewman敲除株, 次日将过夜菌按1∶100体积比转种2 mL 新鲜TSB液体培养基，37 ℃振摇培养16 h后取1 mL菌液用TCA-丙酮蛋白浓缩法浓缩沉淀上清蛋白；用60 μL PBS溶解沉淀后加入蛋白上样缓冲液，煮沸10 min后，进行SDS-PAGE分析.

1.2.5 实时荧光定量PCR(RT-PCR)

37 ℃过夜培养金葡菌Newman野生株和ΔagrB/D/CNewman敲除株，次日将过夜菌按1∶100体积比转种2 mL 新鲜TSB液体培养基，37 ℃振摇培养至对数生长期，取200 μL菌液进行细菌总RNA抽提：菌液离心集菌后，重悬于100 μL (Tris-EDTA,TE)缓冲液(含质量浓度为3 mg/mL溶菌酶和10 μL 质量浓度为1 mg/mL的溶葡萄球菌素)，37 ℃作用0.5 h破坏细菌细胞壁，而后参照Promega公司的RNA抽提试剂盒说明书进行细菌总RNA提取.用gDNA Eraser(Takara公司)去除基因组污染后，用primescript RT Reagent Kit(Takara公司)进行反转录反应.cDNA样本经稀释后，用SYBR Premix ExTaqTMⅡ (Tli RNaseH plus)试剂(Takara公司)对Newman野生株及敲除株的hla，hlb， pvl等毒力基因及受Agr调控的转录因子的转录水平进行定量RT-PCR分析比对.RT-PCR反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 8 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40 循环.

1.3 统计学方法

本实验统计学分析采用 SPSS 19.0软件和GraphPad Prism 6.0 软件，用t检验比较两组数值差异，P<0.05代表具有统计学差异.

2 结果

2.1 ΔagrB/D/C/Newman敲除株的筛选与鉴定

以金葡菌Newman 基因组为模板，以agrB/D/C-up引物对扩增得到同源左臂片段803 bp，以agrB/D/C-down引物对扩增得到同源右臂片段957 bp.用限制性内切酶处理后，在T4 DNA连接酶的作用下克隆入穿梭质粒pBT2构建pBT2∷agrB/D/C敲除质粒.pBT2∷agrB/D/C/质粒经RN4220限制修饰以后电转Newman 感受态.利用PCR鉴定敲除株.结果显示：以agrB/D/C-for、agrB/D/C-rev特异引物对扩增时，以野生株为模板扩增出2 024 bp片段(图1泳道1)，而敲除株未能扩增出条带(图1泳道3、5)；以agrB/D/Cup-for、agrB/D/Cdown-rev为引物对扩增，以突变株为模板扩增出的片段(1 760 bp，图1泳道4、6)明显小于以野生株为模板扩增出的片段(3 784 bp，见图1泳道2)，提示agrB/D/C基因已从Newman基因组中成功敲除.将PCR产物送出测序证实ΔagrB/D/C/Newman敲除株构建成功.

M: 核酸标准；泳道1、2为Newman野生株；泳道3、4、5、6为ΔagrB/D/C/Newman敲除株.

M:DNA Marker; lane 1、2 refers to wide type Newman; lane 3、4、5、6 refers toΔagrB/D/CNewman mutant strain.

图1ΔagrB/D/C/Newman敲除株的PCR鉴定

Fig.1 Identification of knocked outagrB/D/Cgene in Staphylococcus aureus by PCR

2.2 ΔagrB/D/C/Newman敲除株生物学特性

对野生株以及敲除株的溶血活性、色素、生物膜形成能力等生物学特性进行分析，结果表明，ΔagrB/D/C/Newman敲除株的溶血活性显著低于野生株(图2A)；过夜培养Newman野生株与敲除株,与野生株Newman相比，ΔagrB/D/C/Newman敲除株色素形成能力减弱，形成灰白色的菌落(图2B).用结晶紫染色法测定野生株与敲除株生物膜形成能力，结果显示，ΔagrB/D/C/Newman敲除株的生物膜形成能力显著高于野生株(图2C).

WT：wild type，Newman 野生株； Mu：mutant,ΔagrB/D/C/Newman敲除株. A:溶血现象；B:色素形成能力；C:生物膜形成能力.

WT: wide type, Newman wide type strain; Mu:mutant,ΔagrB/D/CNewman mutant strain. A:hemolytic ability; B:pigment formation; C:biofilm formation ability.

图2 Newman野生株及ΔagrB/D/C敲除株生物学特性

Fig.2 The biological characteristics of Staphylococcus aureus Newman andΔagrB/D/C/Newman

2.3 ΔagrB/D/C/Newman敲除株培养上清蛋白

37 ℃ 过夜培养金葡菌Newman野生株和ΔagrB/D/C/Newman敲除株次日按1∶100体积比转种新鲜TSB培养基培养18 h，离心收集培养上清，TCA法沉淀上清蛋白，而后经质量分数为10% 的SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色.结果显示：ΔagrB/D/C/Newman敲除株与野生株培养上清的蛋白表达谱有显著差异.与Newman野生株相比，agrB/D/C的敲除可导致多个分泌蛋白表达水平明显降低(图3)，同时也会导致部分蛋白表达上升，这可能与 Agr 系统活性降低有关.将野生株和ΔagrB/D/C敲除株差异蛋白条带进行质谱分析，结果显示ΔagrB/D/C敲除株上清蛋白与野生株蛋白差异最大的几条主要条带分别为α-溶血素(alpha-hemolysin，hla)相对分子量为41.00;γ-溶血素(gamma-hemolysin， hlgB)相对分子量为35.00;酚溶调蛋白(phenol-soluble modulin，psm)相对分子量为44.00; 丝氨酸氨酸蛋白酶(staphylococcal serine proteinase A，sspa)相对分子量为25.00等(表2)，表明金葡菌的这些毒力因子的表达主要受 Agr 系统调控.

M:marker,蛋白质标准；WT:wide type, Newman 野生株；Mu:mutant;ΔagrB/D/C/Newman敲除株.

M: marker,protein Marker; WT: wide type, Newman wide type strain; Mu:mutant; ΔagrB/D/C Newman mutant strain.

图3 Newman 野生株及ΔagrB/D/C敲除株培养上清蛋白电泳

Fig.3 Effect ofΔagrB/D/Cgenes knocking out on the exoprotein of Staphylococcus aureus by SDS-PAGE

2.4 qRT-PCR测定毒力因子转录水平

为进一步检测agrB/D/C敲除之后Agr系统的活性以及毒力因子的表达水平，分别培养Newman野生株及ΔagrB/D/C/Newman敲除株至对数生长期，抽提野生株和敲除株总RNA，逆转录生成cDNA，qRT-PCR技术检测Agr系统相关调控因子和毒力基因的转录水平.结果表明:agrB/D/C敲除后，未检测到agrA的转录(图4)，表明agrB/D/C敲除之后，不能磷酸化AgrA蛋白，agrA不能转录，Agr系统失去活性.溶血素是金葡菌中重要的毒力因子，采用 qRT-PCR 检 测了 RNAIII、 α-溶血素、γ-溶血素、酚溶调节蛋白、lukF等受 Agr 调控的毒力基因的表达情况，结果发现这些毒力基因的表达显著降低.而自溶素(aur)，表面蛋白(surface protein,spa)的表达水平显著升高.

表2 Newman 野生株及ΔagrB/D/C/Newman敲除株上清蛋白质谱分析结果Table 2 Typical proteins of spectrum analysis of Newman wild strain and ΔagrB/D/C/Newman deficient mutant strain

agrA:附属调节基因A;rot:毒素抑制蛋白; sarA:葡萄球菌辅助调节因子A; aur:自溶素; crtN：类胡萝卜素; lukF:杀白细胞素; psmα：酚溶调蛋白α； psmβ：酚溶调蛋白β

WT:wide type, Newman 野生株；Mu:mutant，ΔagrB/D/C/Newman敲除株.

WT: wide type,Newman wide type strain; Mu:mutant;ΔagrB/D/C Newman mutant strain.

图4 Newman 野生株及ΔagrB/D/C/Newman敲除株毒力基因转录水平

Fig.4 Transcriptional levels of virulence genes ofS.aureusNewman and it′s mutant strainΔagrB/D/C/Newman

3 讨论

Agr是金葡菌重要的全局性转录调控因子，通过磷酸化的AgrA蛋白结合于靶基因启动子区域是Agr系统RNAⅡ调控模式调控基因表达的分子机制[10].然而，AgrA的氨基酸序列在金葡菌中是高度保守的.4类Agr系统的不同在于AgrB、AgrD、AgrC蛋白的序列高变性[14].因此推测AgrB、AgrD、AgrC蛋白的差异通过改变AgrA蛋白活性，进而影响Agr系统对靶基因的调控，导致不同Agr类型菌株基因的差异性表达及细菌致病力强弱的改变.由于Agr是一个综合系统，这些变异必须协同进化，以维持Agr功能，使细菌能够逃避宿主防御，在宿主内传播，并降解宿主细胞和组织[15].

研究发现Agr系统通过调节毒力因子、生物膜形成以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的异质性耐药，在发病机制中起着至关重要的作用[15-16].Agr系统可以上调毒力基因的表达，比如α-溶血素、 β-溶血素(hlB)、 γ-溶血素、杀白细胞素、脂肪酶、酚溶蛋白、毒性休克综合征毒素等.抑制细胞壁相关蛋白的转录比如蛋白A，凝固酶，纤连蛋白等[17].为进一步探讨agrB/D/C基因的功能，实验采用同源重组技术对金葡菌Newman菌株的agrB/D/C基因簇进行敲除，成功构建了一株agrB/D/C基因簇(包含agrB、agrD、agrC3个基因)缺失的Newman敲除株.通过对敲除株的溶血活性、色素形成、生物膜形成等生物学特性分析发现，敲除株的溶血活性显著低于野生株.qRT-PCR 结果显示agrB/D/C敲除后，agrA无转录.受Agr系统调控的转录因子和毒力基因水平显著改变，说明agrB/D/C可以影响agrA的转录，进而调控毒力因子表达，增强细菌致病性.金葡菌可以产生金黄色色素，这种金黄色的类胡萝卜素可以增强细菌对氧化胁迫和对宿主嗜中性粒细胞吞噬的抵抗能力，从而帮助细菌逃避宿主的免疫系统，与细菌的毒力有着密切的联系[18].敲除agrB/D/C之后发现金葡菌产生色素的能力明显降低，菌落颜色由原来的金黄色变成了灰白色(图2)，qRT-PCR结果显示，控制色素表达的基因crtN转录水平显著降低.说明金葡菌Agr系统可以正调控色素的形成从而影响细菌毒力.此外，敲除agrB/D/C后，细菌形成生物被膜的能力显著增强，说明Agr负调控生物膜的形成.

以往的研究表明Agr系统调控多个基因的转录表达[19]，本研究发现敲除agrB/D/C基因簇后，敲除株分泌蛋白的种类和数量显著降低，也有少数蛋白表达上升.说明Agr系统调控多个分泌蛋白的表达，但主要以正调控为主.培养上清蛋白表达谱分析，发现agrB/D/C基因簇的缺失可导致金葡菌α-溶血素、γ-溶血素、psm等溶血素表达降低， 表面蛋白A等蛋白表达上升，RT-PCR也证实了该结果.

综上，本研究成功构建了金葡菌ΔagrB/D/C/Newman敲除株，检测到敲除株的生物学特性发生明显改变：溶血活性降低，色素形成能力降低，生物膜形成能力增强.产生的上清蛋白谱中多个蛋白表达水平改变，转录水平也证实多个毒力基因表达改变.本研究为进一步研究不同类型agrB/D/C对金葡菌Agr系统活性及金葡菌毒力基因分泌表达及细菌致病力的影响提供重要前提，为研究金葡菌致病机理以及抗金葡菌慢性感染策略奠定基础.