氨磷汀对急性放射性肠炎小鼠NF-κB通路和VCAM-1、ICAM-1基因表达的影响

张跃伟， 孙锁柱， 张丹， 谢静， 张蓉， 李长政

(1.锦州医科大学 火箭军总医院 研究生培训基地, 辽宁 锦州 121001； 2.中国人民解放军火箭军特色医学中心 病理科, 北京 100088； 3.中国人民解放军火箭军特色医学中心 消化科, 北京 100088； 4.中国人民解放军火箭军特色医学中心 中医科, 北京 100088)

放射性肠炎是腹盆腔放疗患者的主要健康问题，近年来随着结直肠和妇科肿瘤放疗患者的增多，发病率也呈逐年增长趋势.放射性肠炎发病机制复杂，涉及细胞凋亡、微血管损伤、炎症介质表达上调、免疫屏障破坏及肠道菌群失调等多个方面[1-2].其中微血管损伤是放射性肠炎的重要发病机制之一，主要表现为微血管结构破坏、数目减少密度下降、微血管硬化、新生血管异常生长等[3-4].目前对急性放射性肠炎的研究主要集中在细胞凋亡和炎症反应方面，而微血管损伤相对较少.本实验通过观察辐射后第1、7、14天不同时间点的实验组和干预组小鼠小肠组织中核转录因子kappaB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、血管间粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1)基因mRNA表达变化，探讨上述基因在急性放射性肠炎微血管损伤中的生物学意义以及氨磷汀对微血管损伤的保护机制，为临床早期诊治提供依据.

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组

清洁级健康C57BL/10J小鼠84只，3月龄，雌雄各半，雌鼠体质量(20±2)g，雄鼠体质量(28±2)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供.将小鼠随机分成对照组，辐射后第1、7、14天3个不同时间点的实验组和辐射后第1、7、14天3个不同时间点的氨磷汀干预组，共7组，每组小鼠12只.

1.2 实验试剂

固定组织RNA提取试剂盒，由康为世纪生物科技有限公司提供；Green qPCR MasterMix (LowROX)试剂盒由BIOMED公司提供；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，由赛默飞世尔公司提供.

1.3 辐射方法

60Coγ-辐照装置(型号：GM-11-03-A)对实验组小鼠进行一次性6 Gy辐射，小鼠笼置于距辐射源小于30 cm距离内，辐射剂量率为1.00 Gy/min，总时长6 min.干预组小鼠于辐射前30 min腹腔注射氨磷汀，按人体给药用量换算，每千克体质量小鼠给予质量200 mg氨磷汀.

1.4 标本制作和病理切片

分别于辐射后第1、7、14天颈椎脱臼法分批处死实验组和干预组小鼠，第14天处死对照组小鼠，取出小肠，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗至无粪便残留，剪切分段，分别置于体积分数为10%福尔马林中固定和-80 ℃冰箱保存备用.病理切片：常规脱水、透明、包埋、石蜡包埋、组织切片和染色.

1.5 定量PCR(Q-PCR)检测

参照固定组织RNA提取试剂盒说明提取总RNA.参照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行反转录.反应体系为：2×Green qPCR MasterMix 10 μL、10×Low ROX dye 2 μL、Forward Primer (浓度10 μmol/L) 0.5 μL、Reverse Primer (浓度10 μmol/L) 0.5 μL、DNA 2 μL、water 5 μL，共20 μL.反应条件为：95 ℃ 2 min→(95 ℃ 15 s→60 ℃ 30 s)×40个循环→95 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min→95 ℃ 15 s→60 ℃ 15 s.两步法进行Q-PCR，GAPDH为内参.GAPDH引物：上游5′-TCTCCGCCCCTTCCGCTGAT-3′、下游5′-CCACAGCCTTGGCAGCACCA-3′；NF-κB引物：上游5′-CAAGATCTGCCGAGTAAACC-3′、下游5′-TCGGAACACAATGGCCACTT-3′；VCAM-1引物：上游5′-GATAGACAGCCCACTAAACG-3′、下游5′-TGGAGCCAAACACTTGAC-3′；ICAM-1引物：上游5′-TCAGGTATCCATCCATCCCA-3′、下游5′-CGG-TGCCACAGTTCTCAAAG-3′.引物由天一辉远科技有限公司提供.

1.6 统计学分析

采用SPSS23统计软件.采用Student′st检验方法进行统计学分析，P<0.05为有统计学差异.

2 结果

2.1 病理改变

光学显微镜下观察，对照组小鼠小肠黏膜下微血管规律出现，结构完整；辐射后第1天实验组、干预组均可见微血管充血、扩张、红细胞溢出等改变，两组无统计学差异.选取1张有代表性图片与对照组比较，见图1.第7天实验组黏膜下层微血管数量明显减少，血管壁变薄、破坏，干预组剩余血管数量多于实验组，且结构相对完整，见图2.第14天实验组黏膜下层微血管进一步减少，阶段性消失，结构完整的微血管罕见，黏膜、膜下结构紊乱、细胞数目减少，干预组无微血管阶段性消失现象，仍可见结构完整的微血管,见图3.

A：对照组；B：辐射后第1天实验组；C：辐射后第1天干预组. 对照组小鼠小肠组织结构清晰，黏膜下层微血管规律出现；实验组和干预组均可见黏膜下微血管扩张充血，两组无明显差异.

A：Control group; B：Experimental group on the first day after radiation; C：Intervention group on the first day after radiation. In the control group, the structure of the small intestine was clear, and the microvascular of the submucosa appeared regularly. Submucosal microvascular dilatation and hyperemia were observed in both the experimental group and the intervention group. There was no significant difference between the two groups. Select a representative image to compare with the control group.

图1 对照组和辐射后第1天实验组、干预组H.E.染色结果(×400)

Fig.1 H.E. staining results of control group and experimental group and intervention group on the first day after radiation (×400)

A：对照组；B：辐射后第7天实验组；C：辐射后第7天干预组. 实验组黏膜下层结构破坏，微血管数量明显减少，部分区域微血管消失; 干预组第7天黏膜下层结构破坏较轻，剩余微血管数量较实验组多，且结构相对完整，血管壁较厚.

A：Control group; B：Experimental group on the 7th day after radiation; C：Intervention group on the 7th after radiation. In the experimental group, the submucosal structure was destroyed, the number of microvessels was significantly reduced, and the microvessels in some areas disappeared. In the intervention group, the submucosal structure was less damaged, and the number of remaining microvessels was more than that in the experimental group. The structure of the microvessels was relatively complete and the vessel wall was thick.

图2 对照组和辐射后第7天实验组和干预组H.E.染色结果(×200)

Fig.2 H.E. staining results of control group and experimental group and intervention group on the 7th day after radiation (×200)

A：对照组；B：辐射后第14天实验组；C：辐射后第14天干预组. 实验组黏膜下层正常结构紊乱消失，微血管数量进一步减少，阶段性消失，正常结构的微血管罕见; 干预组黏膜下层结构紊乱轻，微血管数量较实验组多，结构完整的微血管多见，无阶段性微血管消失现象.

A：Control group; B：Experimental group on the 14th day after radiation; C：Intervention group on the 14th after radiation. The normal structure of the submucosa in the experimental group was disordered or even disappeared. The number of microvessels is further reduced, and even a phased disappearance occurs. Microvascular with normal structure is rare. In the intervention group, the submucosal structure was less disordered, and the number of microvessels was more than that in the experimental group. The microvessels with complete structure were more common, and there was no phase microvessels disappearance.

图3 对照组和辐射后第14天实验组和干预组H.E.染色结果(×200)

Fig.3 H.E. staining results of control group and experimental group and intervention group on the 14th day after radiation (×200)

2.2 Q-PCR扩增曲线和熔解曲线

各组NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因不同CT值的扩增曲线平行性良好，其倾斜程度基本一致，说明目的基因与内参基因扩增效率一致.上述各目的基因和内参基因熔解曲线均在对应熔解温度上形成明显单峰，说明产物特异性良好.在对照组和各不同时间点实验组、干预组中分别选取一条代表性扩增曲线和熔解曲线(图4～9).

2.3 辐射后实验组NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA表达水平时间变化及组间比较

(1)辐射后实验组NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA表达水平时间变化见图10.结果显示辐射后第1天NF-κB、VCAM-1、ICAM-1 mRNA表达水平显著升高，相对表达量分别为对照组的14.86(P=0.000)、7.49(P=0.000)、9.65(P=0.000)倍；第7天相对表达量分别为对照组的9.82(P=0.000)、3.61(P=0.001)、4.44(P=0.000)倍，表达水平均下降但仍高于对照组；第14天均降至对照组水平(P>0.05).

(2)辐射后干预组NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA表达水平时间变化见图11.结果显示辐射后第1天NF-κB、VCAM-1、ICAM-1 mRNA表达水平显著升高，相对表达量分别为对照组的7.25(P=0.000)、4.23(P=0.000)、6.43(P=0.000)倍；第7天相对表达量为对照组的2.10(P=0.001)、1.32(P=0.082)、1.19(P=0.176)倍，NF-κB仍高于对照组，VCAM-1、ICAM-1达到对照组水平；第14天均与对照组表达无明显统计学差异(P>0.05).

(3)实验组和干预组比较见图12～14.结果显示辐射后第1天干预组NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA表达水平均明显低于实验组，对应P值分别为P=0.000、P=0.001、P=0.013；第7天表达水平同样低于实验组，对应P值分别为P=0.000、P=0.000、P=0.001；第14天干预组、实验组均和对照组表达水平无明显统计学差异(P>0.05).

图4 实验组NF-κB基因Q-PCR扩增曲线和熔解曲线

图5 实验组VCAM-1基因Q-PCR扩增曲线和熔解曲线

图6 实验组ICAM-1基因Q-PCR扩增曲线和熔解曲线

图7 干预组NF-κB基因Q-PCR扩增曲线和熔解曲线

图8 干预组VCAM-1基因Q-PCR扩增曲线和熔解曲线

图9 干预组ICAM-1基因Q-PCR扩增曲线和熔解曲线

图10 辐射后实验组不同时间点NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA相对表达量变化

Fig.10 Changes of relative expression ofNF-κB,VCAM-1andICAM-1mRNA at different time points in the experimental group after irradiation

图11 辐射后干预组不同时间点NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA相对表达量变化

Fig.11 Changes of relative expression ofNF-κB,VCAM-1andICAM-1mRNA at different time points in the intervention group after irradiation

图12 辐射后实验组和干预组NF-κB基因mRNA相对表达量的比较

Fig.12 Comparison of relative expression ofNF-κBmRNA in experimental group and intervention group after radiation

图13 辐射后实验组和干预组VCAM-1基因mRNA相对表达量的比较

Fig.13 Comparison of relative expression ofVCAM-1mRNA in experimental group and intervention group after radiation

图14 辐射后实验组和干预组ICAM-1基因mRNA相对表达量的比较

Fig.14 Comparison of relative expression ofICAM-1mRNA in experimental group and intervention group after radiation

3 讨论

早期研究表明，辐射可导致多种微血管病理学改变，包括毛细血管不规则扩张，不对称和闭塞性纤维化以及从轻微增厚到破碎的基底膜变化等[5].放射性肠炎在内镜下常表现出黏膜下小血管网减少、消失，甚至局部肠壁苍白、僵硬，伴有周围小血管异常扩张，汇聚成簇的“血管集簇”征象[6].这些特征表明微血管的损伤在放射性肠炎中扮演重要角色.但目前对辐射后微血管损伤的研究多集中在慢性放射性肠炎方面，急性放射性肠炎的微血管改变及其机制研究相对较少.同时氨磷汀作为广谱放疗细胞保护剂，对辐射后微血管损伤的保护机制研究也较少.本实验通过观察对比急性放射性肠炎小鼠实验组和干预组的小肠病理学改变及NF-κB通路和VCAM-1、ICAM-1基因mRNA表达变化，探讨了急性放射性肠炎微血管损伤的特征、机制及氨磷汀对微血管保护的相关机制.

本实验病理学观察表明急性放射性肠炎的微血管损伤主要表现为通透性增加，随后破坏微血管密度下降，阶段性消失.早期Dimitrievich等[7]的研究表明，直径小于10 nm的小毛细血管比直径大于10 nm的较大血管具有更高的辐射敏感性.微血管损伤机制涉及微血管内皮损伤，DNA损伤和多种炎症和促纤维化细胞因子的释放.其中毛细血管和小血管内皮损伤和功能障碍在辐射损伤中起着特别重要的作用[8].VCAM-1和 ICAM-1属于免疫球蛋白超家族成员，是血管炎症期间由内皮分泌的关键分子[9].正常情况下VCAM-1、ICAM-1在血管内皮表达量很低，炎症发生时在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)等多种细胞因子触发下表达迅速上调，可通过介导白细胞和血管内皮细胞的粘附级联反应参与炎症反应[10-12].血管内皮细胞表面的VCAM-1可粘附白细胞上表达的α4β1整合素，并激活活化的内皮细胞内允许白细胞跨内皮迁移的信号通路，在白细胞聚集中发挥作用[13].VCAM-1、ICAM-1可作为血管内皮损伤的指标，主要通过NF-κB途径进行表达调控[14].NF-κB为作用广泛的转录调节因子，可通过辐射等多种途径活化，诱导多种细胞因子基因的表达[15].VCAM-1、ICAM-1基因的启动子区域具有NF-κB的作用结合位点，活化的NF-κB可诱导血管内皮细胞VCAM-1、ICAM-1的基因表达，进而参与炎症反应[16].本实验中辐射后第1天实验组NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA表达均同步升高，第7天实验组仍呈高表达，第14天表达降至对照组水平.第7天和14天组织学可观察到微血管破坏、数量减少、阶段性消失等现象.NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因表达高峰为辐射后第1天，组织学损伤的高峰为第14天，组织学损伤与基因表达在时间上存在滞后性，符合从分子学改变到组织学改变的规律.本实验表明辐射可激活NF-κB通路进而激活VCAM-1、ICAM-1基因表达，后者可能通过参与微血管炎症反应在微血管损伤中发挥作用.

氨磷汀是具抗辐射活性的化合物WR-1605的硫代磷酸酯衍生物，可通过清除自由基、减少细胞凋亡等机制对正常细胞起到保护作用[17].另有研究表明[18-20]，氨磷汀通过不依赖于其自由基清除特性的机制保护血管免受放射线的影响.其机制可能为促进内皮细胞生长，促进新生血管增殖，增加微血管数量等.本实验中氨磷汀干预组辐射后第1天、第7天NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA表达均显著低于实验组，且下降速度显著高于实验组.组织学观察提示辐射后第7天和第14天干预组存留微血管数量均多于实验组，且结构相对完整，这种表现随时间延长变得更加明显.这表明氨磷汀可能通过阻断NF-κB通路进而下调VCAM-1、ICAM-1基因表达，减轻辐射后微血管的炎症反应，对放射性肠炎的微血管损伤起到保护作用.

综上，微血管损伤在急性放射性肠炎中发挥着重要作用.微血管的破坏减少主要发生在辐射损伤的早期，可能与NF-κB通路介导的微血管炎症反应有关.氨磷汀可能通过下调辐射后NF-κB通路表达，进而减少VCAM-1、ICAM-1基因表达，对微血管起到保护作用，从而减轻放射性肠炎的损伤.