赤霞珠葡萄皮渣酚类物质提取及抗氧化性研究

2019-12-26毛建利李艳

食品研究与开发 2019年1期

毛建利，李艳，2，*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050018）

我国2017年葡萄酒产量100.1万吨，酿酒葡萄重量的70%可转化为葡萄酒，其余为废弃物，葡萄梗约5%～8%；葡萄皮和葡萄籽分别占果实部分的5%～7%和10%～15%[1-2]，由此可见，葡萄酒生产会产生大量废弃物，如处理不当，会造成环境污染[3]。废弃物葡萄籽、葡萄皮和葡萄梗中含有大量有益物质，梁传红，郑亚蕾等[4-5]通过对葡萄籽成分及功能研究，证明其含有大量多酚类和脂肪酸类物质，包括儿茶酸等酚酸类，黄烷酮类、花色苷类[6]、黄酮醇类等物质及亚油酸等不饱和脂肪酸。多酚类物质有良好的体外抗氧化能力。陶姝颖等[7]的研究显示葡萄皮渣中富含膳食纤维、多酚类和天然色素等植物营养成分，是优质的抗氧化膳食纤维资源。经葡萄酒发酵产生的葡萄皮渣中同样存在着多种有益成分[8]，蕴含着巨大的经济效益，其中含有花色苷[9]、白藜芦醇、齐墩果酸等多种功能性成分，具有良好的体外抗氧化性能[10]。本研究针对我国大面积种植的酿酒葡萄赤霞珠，酿造干红葡萄酒后的废弃皮渣提取酚类物质，并研究提取液的抗氧化性，目的是提高产业的综合加工能力和原料利用率，改善环境，实现变废为宝，为民造福。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

2015年和2016年份，昌黎产区赤霞珠葡萄，采用传统工艺酿造葡萄酒后收集皮渣，经55℃低温烘干，分离葡萄皮和葡萄籽，分别磨粉，过40目筛，备用。

过硫酸钾、抗坏血酸、冰乙酸、无水碳酸钠、乙酸钠（均为分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；DPPH、ABTS标品（均为分析纯）：上海宝曼生物科技有限公司；铁氰化钾、磷酸氢二钠、硫酸锂（均为分析纯）：天津市博迪化工有限公司；磷酸二氢钠分析纯：天津市百世化工有限公司；95%乙醇分析纯：石家庄市新宇三阳实业有限公司；三氯乙酸、没食子酸（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；氯化铁、水杨酸（均为分析纯）：天津市标准科技有限公司；硫酸亚铁（分析纯）：天津市四通化工厂；30%过氧化氢：天津政成化学制品有限公司；浓盐酸：昆山金城试剂有限公司；氯化钾（分析纯）：天津市晶科化工有限公司；乙酸（分析纯）：天津市东丽区天大化学试剂厂；无酸钠（分析纯）：天津市津东天正精细化学试剂厂；钼酸钠（分析纯）：天津市化学试剂西厂；浓硫酸：珠海市华成达化工有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-4数显恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；AR1140分析天平：深圳市时代之峰科技有限公司；DELTA 320pH数字酸度计：梅普勒-托利多仪器有限公司；JJ1000电子天平：常熟市双杰测试仪器厂；SHZ-HI真空泵：上海知信实验仪器技术有限公司；电子万用炉、101-0AB电热鼓风干燥箱、SX-2.5-10马弗炉：天津市泰斯特仪器有限公司；SP-756紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酚类物质成分测定

花色苷：pH值示差法[11]。称取1.50g样品溶于20mL 0.5%HCl酸化的60%乙醇溶液，50℃水浴3 h，离心去上清液。再加入15 mL酸化乙醇，50℃水浴3 h离心去上清液，重复3次，合并3次上清液定容至50 mL测定花色苷含量，求出1.50 g样品中花色苷的质量分数即为样品中花色苷的提取得率。

单宁（以单宁酸计）：福林-丹尼斯法[12]。称取10.00 g样品，于250 mL容量瓶中，加水50 mL放入60℃烘箱中过夜。次日将清液滤至250 mL容量瓶中，残渣加入30 mL热水，80℃水浴20 min。清液滤入容量瓶，再加30 mL热水，80℃水浴20 min重复3到4次直至提取液与10 g/L FeCl3溶液不生成蓝色产物为止。稀释至刻度，离心测定样品提取液对应的单宁吸光度，计算单宁含量，求出10.00 g样品中单宁的质量分数即为样品中单宁的提取得率。

总酚（以没食子酸计）：福林-肖卡法[13]。称取1 g样品，按料液比 1∶10（g/mL）加入 50%乙醇溶解，60 ℃，水浴1 h，冷却过滤后取3 mL定容至25 mL，测定样品提取液对应的总酚的吸光度，计算总酚含量，求出1.00 g样品中总酚的质量分数即为样品中总酚的提取得率。

1.3.2 葡萄皮和葡萄籽中酚类物质提取

1.3.2.1 单因素试验

分别以提取温度、提取时间、乙醇浓度和料液比为变化因素，以总酚提取率为评价指标进行单因素试验。温度（℃）设定为：30、40、50、60、70，固定条件为料液比 1 ∶10（g/mL）、60%乙醇提取 60 min；提取时间（min）设定为：20、40、60、80、100，固定料液比 1 ∶10（g/mL）、60%乙醇、提取温度60℃；乙醇浓度设定为：30%、40%、50%、60%、70%，固定料液比 1∶10（g/mL）、温度60 ℃提取 60 min；料液比（g/mL）变量值为：1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，固定 50%乙醇，60 ℃提取 60 min。

1.3.2.2 正交试验优化酚类物质提取条件

在单因素试验基础上，采用L9（34）正交试验优化酚类物质提取的条件，因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal experimental factor level table

1.3.3 葡萄皮渣中酚类提取物的体外抗氧化性能测定

1.3.3.1 ABTS+自由基清除能力测定

样品ABTS+自由基的清除能力采用分光光度法[14]：

式中：A0为不加样品时的吸光度；A为加入不同量样品时的吸光度。

取1 mL提取液，用提取溶剂稀释成VC同等浓度。

VC用去离子水稀释成终浓度（μg/mL）为 80、90、100、110、120、140、160 的溶液。

取4 mL ABTS工作液，加入100 μL待测液，充分混匀，黑暗环境下反应6 min后于734nm测定吸光值。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力的测定

DPPH的测定方法采用分光光度法[15]：

式中：A空白为不加样品时的吸光度；A样品为加入不同量样品时的吸光度。

VC用去离子水稀释成终浓度（μg/mL）为：10、20、30、40、50、60、70 的溶液。

分别吸取2mL样品和VC溶液于试管中，加入2mL DPPH溶液，使总体积为4 mL，每个样品做3个平行对照，摇匀后避光，室温放置30 min，517 nm测定吸光值，记为A样品。用2 mL提取溶剂代替样品溶液，吸光值记为A空白。

1.3.3.3 羟自由基清除能力的测定羟自由基清除能力的测定采用分光光度法[16]：

式中：A1为加入样品和羟基母体溶液时的吸光度；A2为不加羟基母体溶液时的吸光度；A0为只加羟基母体溶液时的吸光度。

取1 mL提取液，用去离子水稀释成VC同等浓度作为待测液。

VC用去离子水稀释成终浓度（μg/mL）为：50、100、150、200、250、300 的溶液。

取3 mL羟基母体溶液，分别加入1 mL不同浓度的待测液，充分混匀，37℃恒温水浴15 min，530 nm测定各组的吸光值A1（分光光度计用去离子水校零），将羟基母体溶液用等同的提取溶剂代替，其他操作相同记为A2，将样品溶液用等同的提取溶剂代替其它操作相同记为A0。

1.3.3.4 铁离子还原力测定

铁离子还原能力的测定采用分光光度法[17]：

式中：A0我加入样品和试剂时的吸光度；A1为不加样品时的吸光度。取1 mL提取液，用提取溶剂稀释成VC同等浓度。VC用去离子水稀释成终浓度（μg/mL）为：10、20、30、40、50、60、80、120、140 的溶液。

吸取2.5 mL磷酸盐缓冲溶液、2.5 mL铁氰化钾溶液、及不同浓度的2.5 mL样品溶液，充分混匀。50℃水浴20 min后快速冷却，加2.5 mL10%三氯乙酸混匀，3 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加2.5 mL 0.1%FeCl3溶液，反应10 min，在700 nm测定吸光值（A0），将样品用同等体积的提取溶剂替代，其他方法相同，测定吸光度A1。

1.3.4 数据处理

本研究通过 Excel 2003，Origin8.5，SPSS17.0 进行试验数据的汇总与统计分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄皮与葡萄籽中酚类物质提取和测定结果

赤霞珠葡萄酒废弃皮渣经预处理得到的粉状物，在相同提取条件下，料液比1∶10（g/mL）、50%乙醇、60℃、水浴提取60 min，以酚类物质提取率为评价指标，测定结果见图1。

图1 样品的酚类物质的提取结果Fig.1 Results of phenolic extraction of samples

图1可见，葡萄籽中总酚和单宁提取率均高于葡萄皮，分别达到6.82%和0.79%。说明赤霞珠葡萄籽具有潜在提取酚类物质的价值，作为后续正交试验优化提取酚类物质，及抗氧化性能测定选定的样品。由图1还可看到葡萄皮和葡萄籽中花色苷类物质提取率较低，分别为0.10%和0.099%，也有一定的提取价值[18]。说明酿酒过程中对花色苷浸提效果明显，绝大多数花色苷类物质进入葡萄酒中，酿酒工艺条件合适。

2.2 葡萄籽中酚类物质提取单因素实验

分别进行提取温度、提取时间、乙醇浓度和料液比对酚类物质提取率的影响进行单因素试验，结果见图2。

图2 赤霞珠葡萄籽中总酚提取条件的单因素试验Fig.2 Single factor experiment of total phenol extraction conditions from Cabernet Sauvignon grape seed

由图2可知，分别在提取温度60℃，提取时间60 min，乙醇浓度 60%，料液比 1∶10（g/mL）时，酚类物质提取率达到最高值，并出现拐点。众所周知，在浸取过程中，温度影响分子运动的速率，随着温度升高，固体中可溶性物质分子运动加剧，酚类物质渗出、溶解和扩散至溶液中[19]，60℃时总酚提取率最高为6.88%，到70℃时降低，温度过高会破坏酚类物质[20]或加速酚类物质的氧化分解。在恒定温度下，提取时间延长会促使物质溶出，因此呈现上升趋势，达到高峰值后下降[21]，提取60 min时，总酚提取率最高达8.96%，时间再长导致提取液中总酚成分在较高温度下被破坏。乙醇可以改变物质的溶解性，酸化乙醇更利于酚类物质和单宁的溶出，葡萄籽中酚类物质有些是醇溶性的，因此随着乙醇浓度的提高，酚类物质提取总量也会提高，在乙醇浓度达60%，总酚提取率最高达8.99%。料液比是指溶液的固液比例，液体量增加溶液变稀，固体物质的传质阻力变小，传质推动力提高，但整体提取率下降，从工程学角度说不合算。减少溶剂用量可降低能耗、提高提取效率。从图2看，在料液比1∶10（g/mL）附近，总酚提取率最高，达8.51%。

2.3 正交试验优化赤霞珠葡萄籽中酚类物质提取条件

在单因素试验基础上进行正交试验优化赤霞珠葡萄籽中酚类物质提取条件，结果见表2，正交试验方差分析结果见表3。

表2 正交试验优化葡萄籽中酚类物质提取条件Table 2 Orthogonal experiments to optimize the extraction conditions of phenols from grape seeds

由表3可知，各因素的极差大小顺序为C＞A＞B＞D，由此可得出，影响赤霞珠葡萄籽中酚类物质提取率的4个因素先后顺序为：料液比＞提取时间＞提取温度＞乙醇浓度，最优的提取工艺条件为：A2、B3、C3、D2，即提取温度70℃，乙醇浓度为60%，料液比为1 ∶15（g/mL），提取时间 60 min。由表 3 可知，提取时间、提取温度、料液比、乙醇浓度，对总酚提取率的影响极显著。为了考察最优条件的再现性，进行了验证试验。在正交试验最优条件下，进行验证和拟合试验，试验平行3次求得平均值，总酚的平均提取率10.21%。比正交表中最佳提取率提高0.88%。

表3 正交试验方差分析结果Table 3 Orthogonal test variance analysis results

2.4 酚类物质提取物体外抗氧化性研究

2.4.1 酚类提取物对ABTS+自由基的清除性能

以VC为阳性对照，研究赤霞珠葡萄籽酚类提取液对ABTS+自由基的清除率，以VC和提取液浓度为横坐标，ABTS+自由基清除率为纵坐标作图，对比效果见图3。ABTS/ABTS+的氧化还原电位为0.68 V，容易发生电子转移，生成稳定的绿色自由基ABTS+[23]。ABTS溶液在过硫酸钾的催化下发生电子转移，生成稳定呈现绿色的ABTS+自由基。赤霞珠葡萄籽提取物具有还原性，将ABTS+自由基还原并发生褪色反应，褪色的程度与ABTS+自由基得到的电子数目呈现良好的相关性，因此通过溶液吸光值的改变就可了解其抗氧化性强弱。

图3 赤霞珠葡萄籽酚类提取物对ABTS+自由基的清除性能Fig.3 The scavenging performance of ABTS+free radicals by phenolic extracts of Cabernet Sauvignon grape seed

由图3可见，赤霞珠葡萄籽总酚提取液比VC清除ABTS+自由基的能力强，且随着总酚提取液浓度增加，清除率提高，当赤霞珠葡萄籽总酚提取液加入量到100 μg/mL以上时，对ABTS+自由基的清除率能达到100%，由试验结果分析可知，赤霞珠葡萄籽总酚提取物对ABTS+自由基的清除效果明显。

2.4.2 酚类物质提取物对DPPH自由基的清除性能

DPPH自由基有单电子，在517 nm有强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，因与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，褪色程度与其接受的电子数成定量关系，因而可用分光光度计进行快速定量分析，抗坏血酸等具有递电子和递质子能力的抗氧化剂对DPPH自由基的清除作用是通过抗氧化剂把电子和质子传递给DPPH自由基，从而生成稳定的分子态DPPH2的结果[25]。以VC和提取液浓度为横坐标，DPPH自由基清除率为纵坐标作图，对比效果见图4。

图4 赤霞珠葡萄籽酚类提取物对DPPH自由基的清除性能Fig.4 DPPH free radical scavenging performance of phenolic extracts of Cabernet Sauvignon grape seed

赤霞珠籽总酚提取液的加入量在20 μg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到95.00%，随提取液量浓度增加，清除率增加，当提取液的加入量达到30 μg/mL时对DPPH自由基的清除率达到100%。VC溶液对DPPH自由基的清除力明显低于葡萄籽总酚提取液对DPPH的清除能力。

2.4.3 酚类物质提取物对羟自由基的清除性能

羟自由基（·OH）系活性氧的一种，它可以通过发生电子转移，参与夺氢及羟基化等反应与生物体内多种分子作用，引起机体损伤，酚类物质和VC可作为还原剂或自由基清除剂能提供一个氢原子与羟自由基结合形成稳定结构[26]，从而改变整个反应体系的吸光度，由此计算样品对羟自由基的清除性能。以VC和提取液浓度为横坐标，羟自由基清除率为纵坐标作图，对比效果见图5。