激光共聚焦技术在评定饲料酶制剂效果中的应用

2019-12-26孟莹莹杨怀荣马艳艳司彦培周莉芬

中国畜牧杂志 2019年12期

孟莹莹，杨怀荣，马艳艳，司彦培，周莉芬

（青岛根源生物技术集团有限公司，山东青岛 266111）

近年来，酶制剂因其在降解饲料中抗营养因子、保证饲料品质、改善肠道微生物菌群结构、提高养分利用率、优化饲料配方等方面发挥作用[1-4]，饲用酶制剂在畜禽及水产饲料中应用越来越广泛，但同时也存在标准不一、产品良莠不齐等问题，给使用者带来诸多不便[5]。对于选购者而言，其最大的困惑集中在如何比较不同企业的酶制剂、怎样辨别优良适用的酶制剂等问题。目前评估饲料酶制剂方法有常规酶活检测、酶制剂的基本特性、酶制剂的稳定性、应用效果试验等[6-8]，应用效果的试验主要集中在酶解干物质消失率以及还原糖的生成量指标上，但该方法在评价产品效果上存在很大的误区；非淀粉多糖酶的应用主要体现在破坏植物细胞壁对营养物质的包裹作用，而非对纤维素或半纤维素的完全降解[9-11]。本试验旨在研究激光共聚焦荧光定量技术与体外酶解技术相结合在评定饲料酶制剂在酶解原料上的效果，通过细胞结构的变化反映包裹营养物质的非淀粉多糖降解情况，补充饲用酶制剂的评价体系。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂麸皮、豆粕、玉米、菜粕、小麦来源于青岛龙慧饲料厂；木聚糖酶5 万U/g、甘露聚糖酶5 万U/g、纤维素酶1 000 U/g、β-葡聚糖酶5 万U/g 配置成复合酶，单酶来源于青岛根源生物技术集团有限公司；琼脂粉、戊二醛、酒精、石蜡、荧光增白剂、罗丹明B 染液等其他试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验仪器 1150H 徕卡石蜡包埋机，PM2245 徕卡手动轮转切片机及ASP200S 徕卡组织脱水机，LSM710激光共聚焦显微镜，SHA-C 恒温水浴摇床，仿生消化仪，AP-9925N 真空抽滤泵。

1.3 体外酶解试验方法 ①分别称取2.000 0 g 样品麸皮、豆粕、玉米、菜粕、小麦，放人100 mL 三角瓶内，加入非淀粉多糖酶（NSP 酶）复合酶（木聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶）1 mg/g。加入10 mL pH 5.26 的PBS 溶液（磷酸盐缓冲液：柠檬酸-Na2HPO4），加入约0.24 mL（1 mol/L）稀盐酸溶液，调节pH 到5.26。将调整好pH 的样品合均匀后，封口膜封口，放入41℃的恒温水浴锅内，开启水浴锅振荡器，不断振荡（120 r/ min）。放入5 min 后开始计时，继续消化1 h。②取出三角瓶，小心取下封口膜，加入10 mL pH 为2.7 的稀盐酸溶液，加入约2.2 mL（1 mol/L）盐酸溶液将①中样品pH 调到3.18，封口，混匀后继续放入41℃恒温水浴120 r/min，5 min 后开始计时，消化60 min。③取出三角瓶小心取下封口膜。加入30 mL pH 为6.8 的磷酸盐缓冲液（柠檬酸-Na2HPO4），加入10 mol/L 氢氧化钠溶液约0.30 mL，使样品pH 调至7.0（6.8～6.9）。将三角瓶放入41℃恒温水浴锅内120 次/min，5 min 后开始计时，消化240 min。④消化之后，将三角瓶中消化好的样品进行灭活处理，静止备用。

1.4 饲料原料酶解染色激光共聚焦拍照参考Nordlun等[12]的方法：①取材：将体外酶解的样品包埋2% 的琼脂块（按2%～2.5% 的质量分数）中，选择合适的粉体与琼脂干物质的比例，将琼脂块浸泡在2.5%（v:v）的戊醛溶液中固定24 h 以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。②脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75% 酒精4 h，85% 酒精2 h，90% 酒精2 h，95% 酒精1 h，无水乙醇I 30 min，无水乙醇II 30 min，醇苯5～10 min，二甲苯I 5～10 min，二甲苯II 5～10 min，蜡I 1 h，蜡II 1 h，蜡III 1 h。③包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。④切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片，厚4 μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片。水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。⑤脱蜡：用二甲苯脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。⑥染色：0.01%的荧光增白剂和罗丹明B 染液分别染色10 min 后，洗净染色液。⑦封片：用甘油明胶封片。⑧进行激光共聚焦观测。

1.5 统计分析数据分析均用SigmaPlot 12.5 统计软件完成，数据间的比较采用t 检验进行统计分析，P＜0.05和P＜0.01 分别为差异显著性和差异极显著性标准。所有数值均采用平均值±标准误表示，

2 结果

2.1 NSP 复合酶对玉米原料的体外酶解效果由图1-A可见，对照组玉米单层细胞壁结构完整，蛋白质仍被包裹在细胞壁结构中；但在NSP 酶处理组中细胞壁破坏严重，细胞壁断裂，而经NSP 酶处理后玉米原料中的蛋白质部分被释放出来。由细胞壁的蓝色荧光强度统计分析（图1-B）发现，NSP 酶处理组荧光强度极显著低于对照组。可见，NSP 酶能较好地破坏玉米细胞壁，解除植物细胞壁对营养物质的包裹作用。

图1 NSP 复合酶对玉米原料的体外酶解效果

2.2 NSP 复合酶对麸皮原料的体外酶解效果由图2 可见，对照组麸皮的细胞壁结构荧光强度较NSP 酶处理组更强（P＜0.01）。小麦麸皮的细胞壁的最开始从亚糊粉层开始降解，其次水解糊粉层细胞壁胚乳层。

图2 NSP 复合酶对麸皮原料的体外酶解效果

2.3 NSP 复合酶对豆粕原料的体外酶解效果从图3 可以看出，对照组仍有大量的条状蓝色荧光，豆粕中仍有很多豆皮没有消化；经过NSP 酶处理组的豆粕已经没有条状蓝色荧光；且NSP 酶处理组的蓝色荧光强度极显著降低。

图3 NSP 复合酶对豆粕原料体外酶解结果

2.4 NSP 复合酶对菜粕原料的体外酶解效果由图4-A可见，对照组菜粕单层细胞壁结构完整，蛋白质仍被包裹在细胞壁结构中；但在NSP 酶处理组中细胞壁的破坏严重，细胞壁断裂，包裹在其中的蛋白质部分被释放出来。由图4-B 可以发现，组合NSP 酶荧光强度极显著低于对照组。

图4 NSP 复合酶对菜粕原料的体外酶解效果

3 讨论

体外酶解法是指将酶制剂与饲料预混后，模拟动物胃和小肠内消化环境，包括肠道温度、酶液、pH 等[13]，测定干物质以及还原糖的生成量。与传统体外消化法相比，单胃动物仿生消化仪更接近体内消化环境，操作简单、重复性好，可实现体外条件下简单模拟动物胃肠道消化饲料的过程[14]，用于测定干物质及能值的变化。这2 种常用的评价酶制剂应用效果的方法都是间接地通过测定降解指标的变化反映酶制剂的优劣。李敬等[15]通过比较木聚糖酶、纤维素酶、甘露聚糖酶的降解产物和动物机体的消化吸收得出仅利用还原糖生成量来评价酶制剂在动物生长中的作用效果并没有实际意义，因为NSP 酶的应用主要体现在破坏植物细胞壁对营养物质的包裹作用，促进营养物质的消化吸收，生成低聚寡糖，改善肠道微生物菌群等，而非对纤维素或半纤维素的完全降解。低聚寡糖作为一种益生元，具有抗氧化和免疫调节的作用，能够促进有益微生物的繁殖，维护动物肠道健康[9]。李敬等[15]也认为，降解的还原糖含量不能代表酶制剂发挥的效果。

Nordlund 等[12]通过使用激光共聚焦观察组织结构变化，研究酶和酵母培养物对麸皮发酵性和消化率的影响。崔晨晓[16]在麸皮的发酵改性及其在馒头中的应用研究中，同样使用了激光共聚焦技术观察小麦麸皮中的微观结构图，通过酶制剂对小麦麸皮结构的影响变化判定酶制剂在发酵麸皮中的效果。这种弥补了完全依靠生成还原的变化量来评价酶制剂优劣的缺陷。王学东[17]使用激光共聚焦技术研究新型酶制剂改良小麦粉烘焙品质的机理及其应用研究；任江[18]用该技术研究棉纤维表面油渍洗涤机理。综上，采用激光共聚焦技术研究原料的分子结构的变化主要集中应用在食品行业中，该方法通过研究原料结构的变化反映酶制剂效果也得到行业的一致认可。

但在酶制剂行业中，还没有形成使用原料结构的变化评定酶制剂的效果。本试验利用激光共聚焦技术，通过荧光染色对原料酶解前后β-葡聚糖和蛋白的染色标记，观察结构的变化和荧光强度的定量检测，最终反映酶制剂对于原料结构的降解效果和暴露可消化吸收的营养物质。通过小麦的染色试验发现，木聚糖酶首先作用于糊粉层和珠心表层的不溶性戊聚糖，将其转化为可溶性戊聚糖，最后作用于最外层的戊聚糖，因此最外层的戊聚糖可以抵挡酶的作用[19]，亚糊粉层和胚乳细胞壁比糊粉层细胞壁更薄些，更易被酶水解。糊粉层细胞壁含有大部分的戊聚糖和β-葡聚糖，小麦麸皮则含有木质素、纤维素和大量的戊聚糖[20]，多种酶的协同作用能更好地降解细胞壁和麸皮结构，解除植物细胞壁对营养物质的包裹作用。豆皮中纤维含量高[21]，本研究中在对照组可以看到很多蓝色荧光条状，酶处理组却很少，表明大分子的纤维已被降解；菜粕中含有20% 左右的粗纤维[22]，酶处理后蓝色荧光明显减少。

本试验通过对玉米、豆粕、麸皮以及菜粕饲料原料的激光共聚焦拍照，可以清晰地看到原料的结构变化情况，对其进行定性的直观评价，通过荧光强度的分析可以对酶制剂的优劣进行定量的分析。该方法评定酶制剂效果具有直观效果，同时相比还原糖指标分析更加科学。