酶制剂在饲料添加剂维生素A 含量测定中的应用

赵小阳，虞哲高，刘志英，汪忠艳，杨金枢，刘文欣，何剑洋

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081；2.帝斯曼营养产品部中国研发中心，上海 201203；3.中牧实业股份有限公司，北京 101102；4.广州爱保农饲料有限公司，广东广州 510080；5.浙江新和成股份有限公司，浙江杭州 312500；6.巴斯夫维生素有限公司，辽宁沈阳 110141；7.厦门金达威维生素有限公司，福建厦门 361028）

维生素A 可保护上皮组织，维持正常视觉功能，促进机体和骨骼的生长，防治角膜软化、干眼病等[1]。因此，维生素A 多以乙酸酯形式添加到饲料中，用于促进动物的健康生长发育。

维生素A 用作饲料添加剂通常有明胶包埋和淀粉包埋2 种剂型，国标分析方法（GB/T7292-1999）[2]主要针对微型胶囊技术、明胶包埋的产品，测定时需加入碱性蛋白酶，其作用是酶解包埋维生素A 的微囊外膜，使维生素A 释放出来溶于乙醇溶液。事实上，除碱性蛋白酶外，其他商品化蛋白酶制剂如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等也可用于明胶包埋产品中维生素A 含量的测定。对于淀粉包埋产品，尤其是为避免使用动物源性原料带来的安全隐患及出口地区限制，市场上出现的采用双重乳化工艺用淀粉包埋的饲料添加剂维生素A 产品，如何选择更好的方法检测其含量也是企业迫切需要了解的问题。

本文旨在探讨商品化淀粉酶制剂在饲料添加剂维生素A 产品检测中的应用问题。为此，选用菠萝蛋白酶检测了明胶包埋的维生素A 产品含量，结果与用碱性蛋白酶测试的结果吻合，帮助企业扩大了酶的选择空间；通过用淀粉酶检测淀粉包埋的维生素A 产品含量发现，检测结果稳定、准确。

1 材料与方法

1.1 试剂 无水乙醇，国产优级纯试剂；乙腈、异丙醇为色谱纯，购于Fisher Scientific 公司；菠萝蛋白酶：20 万U/g，淀粉酶：1 万U/g，为国产试剂；全反式维生素A 乙酸酯对照品，购于Dr.Ehrenstorfer 公司，含量≥96.0% ；全反式维生素A 乙酸酯标准贮备溶液，自配；全反式维生素A 乙酸酯标准工作溶液，自配。

1.2 仪器设备 分析天平（感量为0.000 1g、0.000 01g），德国Sartorius 公司（SQP QUINTIX224，BP211D）；超声波振荡提取器，美国SmithKline 公司（BRANSON B-32）；高效液相色谱仪，配有紫外吸收检测器（或二极管矩阵检测器），Agilent 1100；0.22 μm 微孔滤膜。

1.3 试验步骤

1.3.1 标准溶液制备 全反式维生素A 乙酸酯标准贮备溶液：精确称取80～90 mg（精确至0.000 01 g）全反式维生素A 乙酸酯对照品，置于50 mL 棕色容量瓶中，加入30～40 mL 无水乙醇，置于超声水浴中处理2 min 使之完全溶解，用无水乙醇稀释到刻度，摇匀。全反式维生素A 乙酸酯标准贮备溶液的浓度约为1 600～1 800 μg/mL（可密闭冷冻保存12 个月）。

全反式维生素A 乙酸酯标准工作溶液：准确吸取全反式维生素A 乙酸酯标准贮备溶液10 mL 于100 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇稀释到刻度，摇匀，配成160～180 μg/mL 的全反式维生素A 乙酸酯标准工作溶液（可密闭冷冻保存2 个月）。

1.3.2 超声提取时间的确定 GB/T7292-1999 方法中，试样超声提取10 min，但对于不同生产企业的产品，由于包埋工艺不同，提取效果有差异，因此首先分别对试样超声提取10、30、40 min，以确定最适时间（表1）。由表1 可知，超声提取30 min，提取完全，结果稳定，40 min 时测定值呈下降趋势。

1.3.3 酶解提取 根据酶的最佳酶活条件，选择适合的提取温度及提取溶液，见表2。碱性蛋白酶组依据GB/T7292-1999 方法：称取200 mg 试样，加入200 mg 碱性蛋白酶、10 mL 0.1%氨水溶液，45℃超声波水浴中处理30 min，再用乙醇提取稀释，用外标法定量。菠萝蛋白酶和淀粉酶组方法为：称取100 mg（精确至0.000 1g）试样，置于100 mL 棕色容量瓶中，加入100 mg 菠萝蛋白酶、10 mL 水，于55℃超声水浴中超声提取30 min（或者加入100 mg 淀粉酶、10 mL 水，于70℃超声水浴中超声提取30 min），冷却至室温，加入无水乙醇振摇提取，然后用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm滤膜过滤，高效液相色谱检测。

1.3.4 直接提取 准确称取100 mg（精确至0.000 1g）试样，置于100 mL 棕色容量瓶中，加入10 mL 水，45℃超声水浴中超声提取30 min，加入无水乙醇振摇提取，然后用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm滤膜过滤，高效液相色谱检测。

1.4 色谱条件

1.4.1 色谱条件的选择 同GB/T7292-1999 方法[2]。色谱柱：LiChrospher 100RP-18，内径4.6 mm，长250 mm，粒度5 µm，或性能相当者。流动相：乙腈+异丙醇+水=1 500+250+250。流速：1.0 mL/min。检测波长：326 nm。进样量：5 µL。全反式维生素A 乙酸酯色谱峰见图1，维生素A 乙酸酯色谱图见图2。

图1 全反式维生素A 乙酸酯色谱图

图2 维生素A 乙酸酯色谱图

1.4.2 色谱柱的选择 在色谱分离中，不同品牌的C18色谱柱对于顺、反式维生素A 乙酸酯的分离情况是存在差异的，有些C18柱无法将顺、反式维生素A 乙酸酯分开，由于维生素A 乙酸酯的含量是以顺、反式维生素A 乙酸酯之和计算，因此是否将顺、反式维生素A乙酸酯分开对检验结果没有影响。本研究使用的一种色谱柱能够分离顺、反式维生素A 乙酸酯，根据表3 测试结果，顺式维生素A 乙酸酯占总维生素A 乙酸酯的量不超过9%。

1.5 主要技术内容分析论证

1.5.1 线性范围 准确称取103.2 mg维生素A乙酸酯对照品，用乙醇溶解定容至100.0 mL，制备成3 000 IU/mL 的维生素A 乙酸酯标准贮备液，稀释成浓度为150～2 400 IU/mL标准工作溶液，进样5 μL 至高效液相色谱仪。如图3 所示，当维生素A 乙酸酯的浓度在150～2 400 IU/mL 时，回归系数为0.999 42，浓度和峰面积之间存在很好的线性。

表1 不同提取时间的检验结果

表2 酶的提取条件

表3 顺、反维生素A 乙酸酯含量比值

1.5.2 顺式和反式维生素A 乙酸酯的定性试验 由于饲料级维生素A 乙酸酯都是化学合成的，在合成过程中，会生成少量维生素A 乙酸酯顺式异构体，同样具有维生素A 的效价，因此在计算时应将维生素A 乙酸酯的顺-反异构体峰面积合并计算。

称取约85～90 mg 全反式维生素A 乙酸酯对照品，溶于100 mL 乙醇中。吸取5.0 mL 标准贮备液于50 mL容量瓶中，用0.000 1 mol/L 的碘甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，放置10 min 后，滴加数滴1%硫代硫酸钠溶液，使容量瓶中的黄色溶液褪色，将该溶液注入高效液相色谱仪，即得含全反式维生素A 乙酸酯和顺式维生素A乙酸酯的标准溶液，色谱图见图4。

2 结果

图3 维生素A 乙酸酯不同浓度标准溶液与峰面积响应值线性关系

图4 全反式维生素A 乙酸酯和顺式维生素A 乙酸酯色谱图

由表4 可知，用碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶酶解处理7 批次不同生产厂商生产的明胶包埋饲料添加剂维生素A 的微囊产品，得到的结果与标示值非常吻合。实验数据为商品化蛋白酶制剂在饲料添加剂维生素A 含量测试中的酶的选择提供了空间。表4 还比较了用碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶及淀粉酶酶解处理4 批次用淀粉包埋的饲料添加剂维生素A 的微囊产品。从结果上看，用这3种酶酶解处理试样获得的结果无明显差异。

由表5 可知，对于用明胶包埋的维生素A 乙酸酯微囊，测试结果均低于产品标示量，用淀粉包埋的测试结果与产品的标示量相吻合。

通过检测7 家生产企业生产的饲料级维生素A 乙酸酯含量，检测结果均不低于标示值，用不同酶酶解提取检测结果相对偏差不大于3%，表明检测准确度高。

3 讨 论

在生产过程中将适量的维生素A 油、抗氧化剂及明胶通过喷雾干燥，即制成明胶包埋的维生素A 的微囊产品。由于交联作用，部分维生素A 油油滴包裹在明胶基质内，而明胶不溶于水，这些包裹在明胶内的维生素A 油油滴不能释放出来，导致用直接提取法测定维生素A 的提取率低，测定结果均低于产品的标示量。而对于淀粉包埋的维生素A 的微囊产品，由于产品的基质为可溶于水的淀粉，用水超声处理后，淀粉扩散到水中，破坏了产品的微囊结构，微囊内的维生素A 易被有机溶剂所提取，测试结果与产品的标示量相吻合。

对于明胶包埋的维生素A 微囊产品，在样品前处理过程中，通常采用皂化的方法（如饲料中维生素A的测定）或酶解的方法（如饲料添加剂维生素A 的测定）破膜后，再用有机溶剂提取。但对于明胶包埋的维生素A 微囊产品分析来说，关注点在于将明胶交联的结构打破，用有机溶剂将基质内的维生素A 提取出来。本研究用菠萝蛋白酶酶解饲料添加剂维生素A 的微囊产品得到了满意结果。

表4 酶解提取检测结果

表5 直接提取测试结果

淀粉酶酶解处理与其他2 种处理方法有所差异。这是因为试样的基质是淀粉，用碱性蛋白酶或菠萝蛋白酶处理试样起作用的是水，在试样超声过程中，包埋微囊的淀粉溶于水而分散于水中，维生素A 易被下一步加入的乙醇所提取。用淀粉酶酶解处理，除包埋微囊的淀粉溶于水而分散于水中之外，淀粉酶还能够使大分子的淀粉结构酶解成小分子的单糖结构。在某些特定条件下，用商品化淀粉酶制剂测定淀粉包埋的饲料添加剂维生素A 的微囊产品还是有意义的。因为对于用淀粉包埋的维生素A 微囊，储存条件不当或放置时间过长，会使淀粉老化，试样用水处理时，会有部分淀粉不溶，导致部分维生素A 的油滴包裹在不溶淀粉基质内部，低估了实际的含量，而用淀粉酶酶解处理能解决淀粉老化导致含量偏低的问题。

此外，顺式维生素A 乙酸酯含量反映维生素A 乙酸酯生产工艺质量，使用企业在送检产品时可提出检测顺式维生素A 的含量。本研究中分离顺反式维生素A 乙酸酯时所用的色谱柱为LiChrospher®100RP-18 4.6×250 mm 5 μm，但该品牌的色谱柱并非是本方法唯一指定的色谱柱，凡能达到相同结果的其他品牌色谱柱也能使用。

4 小 结

本研究通过对碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶及淀粉酶酶解提取方法的验证表明，对于明胶包埋的维生素A 乙酸酯，用碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶酶解可以提取完全，测试结果稳定。对于淀粉包埋的维生素A 乙酸酯，根据淀粉易溶于水的性质，无论用哪种酶酶解，由于加水超声提取，都能提取完全；也可以选择不加酶，直接加水超声提取，可降低试验成本，提高试验效率；如果淀粉包埋的产品检测结果低于标示值，可先查看其保质期，之后最好用淀粉酶酶解处理再次检测。本研究介绍的分析方法适用性强，准确度高，分析成本低，可为饲料级维生素A 的检测提供有效的检测依据。