一株大黄鱼致病性溶藻弧菌的分离鉴定与毒力相关基因分析

陈洪清

(宁德市水产技术推广站，福建 宁德 352103)

大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)是我国养殖产量最大的海水经济鱼类[1]，随着养殖规模的扩大和养殖密度的提高，大黄鱼病害问题越发突出[2]，其已经成为制约大黄鱼产业发展的瓶颈，其中弧菌病是大黄鱼养殖中较为流行的一种危害严重的细菌性疾病[3-4]。弧菌病的危害对象包括了大黄鱼、石斑鱼(Epinephelussp.)、真鲷(Pagrosomusmajor)等福建省主要海水养殖鱼类，体表溃疡、出血，鳃丝腐烂是弧菌病的主要症状[5-7]。2018年6月，宁德蕉城大湾渔排部分体重约为100 g大黄鱼表现出体表和鳍条溃疡、出血，鳃缺损等症状，并出现零星死亡。镜检体表和鳃丝未发现大量寄生虫，从患病鱼鳃分离得到一株优势菌株，本研究对该菌株进行了生理生化鉴定、16S rDNA测定和毒力因子检测，为该病的病原确定和防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 生化试剂

TCBS和TSA培养平板、TSB培养基以及生化鉴定管购自广东环凯微生物科技有限公司；细菌DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)购自TaKaRa公司。

1.1.2 引物

本研究所用的引物如表1所示，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR扩增所用的引物和序列Tab.1 Primers and sequences for PCR amplification

1.1.3 实验鱼

回归感染所用的健康大黄鱼体重为(20±2)g，暂养于宁德市富发水产有限公司体积为2 000 L的玻璃纤维桶中，暂养条件为水温25℃，水体500 L，溶氧5 mg/L，日常投喂天马公司的大黄鱼配合饲料，每日投喂1次，日投饵率为1%。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离

患病大黄鱼来自宁德蕉城大湾渔排，表现出明显体表和鳍条溃疡、充血(图1)，鳃缺损、充血等症状。将大黄鱼置于氧化袋中，活体运至实验室进行细菌分离，在超净工作台下，用酒精棉球(含70%酒精)擦拭体表，用无菌解剖剪剪下鳃盖，将无菌接种环探入鳃丝缺损处，划线于TCBS培养基平板上，于28℃培养24 h后从形态一致的优势菌落中挑取一个单菌落接种于TSA平板继续纯化，28℃继续培养24 h后，挑取一个单菌落用TSB培养液扩大培养。

1.2.2 分离菌株的生理生化鉴定

用接种环在无菌条件下挑取TSA平板上的单菌落接种于生化鉴定管，按使用说明书培养，观察其生理生化特征。参照《伯杰氏系统细菌学手册》(第九版)[11]，并对比标准株的生理生化特性，对其进行鉴定。

1.2.3 分离菌株的16S rDNA鉴定

从TSA平板挑取单菌落，接种于10 mL TSB培养液，于28℃以120 r/min转速培养24 h，200×g离心10 min，收集菌体，按照OMEGA细菌DNA提取试剂盒方法提取菌体DNA作为PCR模板，PCR体系为Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye) 25 μL，模板1 μL 引物27F(10 μM)2 μL，引物1492R(10 μM)2 μL，无菌水20 μL。PCR反应条件为94℃ 预变性2 min；94℃ 35 s，55℃复性 45 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒纯化后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将所得序列输入NCBI数据库进行Blast比对，通过Clustal X 2.0和Mega 4.0分析构建系统发育树。

1.2.4 分离菌株致病性

将大黄鱼分为6组，每组20尾，在水温25℃时，分别用不同数量的菌腹腔注射回归感染，菌液的稀释液为生理盐水，每尾注射200 μL，各组感染的菌数如表2所示。连续观察10 d后，根据寇氏法公式lg LC50=XK- C∑[Pi+P(i+1)]计算该菌对大黄鱼的半数致死剂量。其中：XK为最大剂量的对数；C为相邻剂量比值的对数；Pi、P(i+1)为各剂量组的死亡率。

表2 回归感染各组的菌数Tab.2 Number of bacteria in each group of regression infection

1.2.5 分离菌株毒力相关因子检测

分离菌株毒力相关基因进行检测，PCR体系为：Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye) 25 μL，菌DNA模板1 μL 上游引物(10 μM)2 μL，下游引物(10 μM)2 μL，无菌水20 μL。PCR反应条件95℃ 3 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 40 s，34个循环；72℃ 7 min。反应完成后对PCR产物进行2%琼脂糖电泳检测。

2 结果与分析

2.1 细菌分离

分离得到的菌接种TCBS平板后，得到均一的，表面光滑、有黏性、直径1～2 mm的圆形黄色菌落(图2)。

2.2 分离菌株生理生化鉴定

菌株的生理生化特征如表3所示，对照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)和标准株17700的生化特性，证实所分离得到的菌为溶藻弧菌，将所得到的菌命名为Val180620。

表3 菌株Val180620的生理生化鉴定结果Tab.3 Physiological and biochemical identification results of strain Val180620

续表3

注：“+”为反应阳性，“-”为反应阴性，“R”为抗性，“S”为敏感, “OF”为氧化发酵型。
Notes: “+”positive, “-” negative, “R”resistance，“S” sensitive，“OF” oxidative fermentation.

2.3 分离菌株16S rDNA鉴定

经测序，可知菌株Val180620扩增得到的16S rDNA基因长度1 517 bp，将该基因序列提交Genebank，Genebank登录号：SUB6036977，通过与Genebank上相关菌株16S rDNA基因的同源性比较，发现该菌与溶藻弧菌的同源率为99%(图3)。

2.4 细菌的致病力

Val180620人工感染结果如表4所示。根据寇式公式，计算得到该菌的半数致死量LD50为2.38×106CFU。

表4 菌株Val180620感染后大黄鱼死亡情况表Tab.4 Death of the Large yellow croaker after infection with strain Val180620 %

2.5 细菌毒力相关因子携带情况

毒力相关基因PCR结果如图4所示，Val180620携带有毒力因子CollagenaseVA、ToxR、FlaA和TRH。

注：M为DNA标准分子量DL2000；1为Collagenase基因；2为ToxR基因；3为UreR基因；4为FlaA基因；5为TRH基因；6～10为空白对照。
Notes：M.DNA marker(DL2000)；Lane 1.Collagenase gene；Lane 2.ToxR gene；Lane 3.UreR gene；Lane 4.FlaA gene；Lane 5.TRH gene；Lane 6～10.Control.

3 讨论

溶藻弧菌广泛分布于世界各海域，且数量居海洋弧菌之首[13]。本研究从患病大黄鱼分离到的优势菌，表现出溶藻弧菌的典型生理生化特征，其16S rDNA与溶藻弧菌的同源率达到99%，证实其为溶藻弧菌，但从系统发育树来看，该菌16S rDNA与GENE BANK中的溶藻弧菌KC884661.1和KC884629.1仍有一定的遗传距离。

溶藻弧菌具有致病性，本研究的回归感染实验证实，Val180620对(20±2)g大黄鱼的半致死量为LD50为2.38×106CFU，钱荣华等用临床分离得到的溶藻弧菌对(50±10)g的大黄鱼进行腹腔注射感染，其半致死量为2.0×107CFU[12]。二者半致死量存在差异，这种毒力差异除了与菌株的培养条件以及感染鱼的大小有关系外，与菌株本身的差异也有关系。

为寻找与该菌致病力相关的基因，本研究对该菌胶原蛋白酶Collagenase、ToxR蛋白、鞭毛蛋白FlaA、脲激酶UreR和溶血素TRH等毒力基因进行了检测，发现该菌存在CollagenaseVA、ToxR、FlaA和TRH基因。本次发病鱼表现出体表溃疡、鳃缺损等症状，而胶原蛋白酶Collagenase在一定pH和温度等条件下可特异水解胶原蛋白[14]，暗示着该酶有可能在引起发病鱼溃疡等症状过程中发挥着作用。ToxR基因、TRH基因均与溶血相关[15-19]，本次发病鱼表现出明显的出血症状，与这二个基因的存在应有密切的关联。FlaA是与运动相关的鞭毛蛋白的重要组成基因，与菌的侵染能力相关[20]，该基因的存在应是菌株Val180620表现出较强致病力的原因之一。有报道称UreR在病原感染的多个致病过程中发挥着作用[21]，与冼钰茵的研究结果一致[22]，本研究也未从菌株Val180620中检测出UreR基因，但菌株Val180620仍表现出较强的致病性，说明UreR不是决定溶藻弧菌毒力的主要因子。

目前，在大黄鱼养殖过程中，弧菌病的防控仍以化学药物治疗为主，抗生素等药物的过度使用易导致病原产生耐药和水产品药残等问题。免疫防控是水产病害防控的必然趋势。本研究结果表明溶藻弧菌Val180620中存在CollagenaseVA、ToxR、FlaA和TRH等毒力相关基因，对这些基因进行深入研究，有望为溶藻弧菌的亚单位疫苗的研发提供帮助。