电刺激获得观赏螯虾天空蓝魔精荚条件的优化

洪 伟，王国栋,2*，宋紫玉，谯江华

(1.集美大学水产学院，福建 厦门 361021；2.农村农业部东海海水健康养殖重点实验室，福建 厦门 361021)

天空蓝魔是一种观赏螯虾，学名为Cheraxdestructor，是Cheraxdestructor人工培育获得蓝体色变异的俗称。Cheraxdestructor分类上属十足目蜊蛄科螯虾亚科破坏者Destructor亚属，原产于美国或西澳洲[1]。天空蓝魔具有通体鲜亮的蓝色和一对霸气的大螯，体型较大，观赏价值高，深受水族爱好者喜爱。因其生性好斗，死亡率高，亲本交配率低，育苗产量少，市场供不应求[2-3]。天空蓝魔的人工繁殖技术瓶颈有待突破。天空蓝魔具开放式纳精囊，属开放式纳精囊繁殖类型。同属开放式纳精囊繁殖类型的凡纳滨对虾人工授精已取得成功[4]，相关技术比较成熟，为天空蓝魔实现人工授精、突破繁殖技术瓶颈提供了有益的参考。而人工获取精荚是实现人工授精的关键一步[3]。

目前，人工获取天空蓝魔精荚方法，大致有解剖法[5]、挤压法[6- 7]、电刺激法[8]等。其中电刺激获取精荚的方法已经被多数学者所认可，获取的精荚及精荚内的精细胞形态正常，雄虾死亡率低，且电激采精的雄虾还可多次成熟、重复采精，明显优于其他获取方法[8]。Jerry[9]已经使用电刺激成功获取天空蓝魔的精荚。本文通过电刺激雄性天空蓝魔第五步足基部生殖孔前后，在不损伤虾体可排出精荚前提下获取精荚，对刺激电压、频率、持续刺激时间等条件进行优化。

1 实验材料与方法

1.1 亲虾培育

实验室自养的人工天空蓝魔，于2018年9月产出，共2缸(50～80尾/缸)，喂养血虫，7～9月龄分离用于试验。

天空蓝魔亲虾用圆筒状网笼(直径10 cm，高40 cm)相互隔离，吊挂在规格为1.5 m×0.7 m×0.7 m水槽中。网笼上缘离水面10 cm以防止螯虾攀爬。水温(22.5±2.0)℃，pH 7.2～7.5，水体溶解氧高于5 mg/L。每日换水量为1/3，饱食性投喂冰鲜南极磷虾肉。

本次试验用于优化的天空蓝魔亲虾37尾，体长(6.1±0.8)cm、体重(13.3±1.2)cm。其中最小规格为体长5.2 cm、体重11.6 g，最大的规格为体长18.6 cm、体重76.23 g。

1.2 电刺激获取精荚操作方法

试验前，将雄性天空蓝魔放置10℃左右的水中，降低其活动能力。设置生理多用仪(YSD-4G，安徽正华生物仪器设备有限公司)相应的参数后，将活动能力降低的雄性个体固定。将正极置于雄虾一侧的第五步足基部生殖孔前，负极置于同侧的第五步足基部生殖孔后[8]。

打开控制开关，进行电刺激后，雄性可能双侧生殖孔都排出精荚，也可能只有一侧排出精荚或没有排出精荚。排出的精荚有些是完全排出，有些只排出部分。统计精荚排出的情况，并将精荚收集在1.5 mL离心管中备用。试验后将天空蓝魔放回原处继续培养。

为了便于描述，将统计情况进行了如下定义，精荚完全排出为电刺激后精荚完全排出或用眼科镊夹住精荚基部全部取出。精荚不完全排出指电刺激后精荚仅排出小部分，借助眼科镊尚无法夹出。一尾螯虾具有两个精荚。

精荚排出率=[获取精荚数/(试验尾数×2)]×100%

精荚完全排出率=[精荚完全排出数/(试验尾数×2)]×100%

精荚不完全排出率=[精荚不完全排出数/(试验尾数×2)]×100%

1.3 精荚显微观察

将获取的精荚，放在载玻片上，在倒置显微镜(XD-202，南京瑞元光学仪器有限公司)直接观察精荚，并采用EZ-MET.Ink软件拍照。

1.4 精荚内精子数量测算

将电刺激获取的精荚放入1.5 mL离心管中，加入1 mL 100%分析纯乙醇固定24 h。2 000 rpm离心(5418R，德国艾本德公司)5 min，舍弃上清液，加入200 μL精荚溶解液(4.0 g蛋白酶K+ 0.6 g NaCl+100 mL灭菌水)，每隔1 h摇匀直至完全溶解，吸取800 μL PBS缓冲液(pH=7.0)制成1mL精子细胞溶液。将其过300目筛绢去除大颗粒沉淀，吸取1 μL PI工作液(碘化丙啶，10 μg/L)，室温遮光染色40 min，使用流式细胞仪(A00-1-1102，贝克曼库尔商贸有限公司)检测分析精荚内精子细胞数量。

公式中，颗粒数是流式细胞仪分析时获得的阳性颗粒数；样本流速为流式细胞仪进样的速度；时间为进样时间；样本总量为精荚溶解后的总体积。

2 实验结果与分析

2.1 电刺激条件的初步确定

当电压为0～25 V时，电刺激亲虾无反应，当电压为30 V时，可以电出精荚。当电压为60 V时，电刺激部位会被灼伤，表现为刺激部位立即烧焦或几天后刺激部位出现黑色肉坑。一旦灼伤，蜕壳多次都难以恢复。因此，将电压范围控制为30～55 V。为了避免亲虾的机体损伤，大于60 V的电压刺激在水中进行，刺激部位同离水刺激，这时亲虾不排出精荚，虾体剧烈抽搐，并且排粪，没有死亡现象。

研究表明，在5～10 mA、40～50 Hz的条件下，可获取精荚[8]。由于生理多用仪频率输出不可连续调节，因此频率设置为32 Hz和64 Hz调节。在此频率下电压为30～55 V时，可刺激排出精荚。改变频率后，未发现结果产生变化，因此将频率调为32 Hz。

当电刺激时间为2 s时，亲虾活动容易造成接触时间不够，影响精荚排出。4 s就可以较好避免这种情况，8 s、16 s与4 s没有明显差异。因此电刺激时间设置为4 s。

2.2 电压条件优化

表1 不同电压下精荚排出率Tab.1 Electrical rate of spermatophore under different voltages

由表1可知，当频率固定为32 Hz时，电压在30～45 V的范围内，电压与精荚排出率正相关。当电压为45 V时，精荚完全排出率最高。当电压值为50～55 V时，精荚排出率高，且精荚排出的速度很快，但会灼伤电刺激部位，且其完全排出率低于45 V的。

2.3 精荚的形态

当优化的条件确定，将获取的完整精荚，放置于载玻片上，滴加无菌水后直接观察。肉眼观察为白色丝状聚集物，可拉伸为直线，具有较强的黏性，遇水后，呈胶状，黏性消失。精荚的显微结构如图1所示，精荚为连续的管状结构，此称精荚小管，通过一种粘胶状的基质将精子包围其中[8]；在精荚小管内含多个精子，可见液体在精荚内流动。

2.4 精荚内精子数量

表2 精荚所含精子数量Tab.2 Sperm counts in spermatophores

当优化的条件确定，选取最大规格48月龄父本螯虾、7～9月龄螯虾进行试验获取精荚。由表2可知，单个精荚内精子数量在5.2×104～1.13×106个之间，同一尾雄虾不同侧生殖孔中排出的精荚中精子数量，无明显差异；可能存在体重增大精子数量增多的关系。

3 讨论

3.1 电刺激条件的初步确定及优化

与解剖法、挤压法相比，电刺激法不失为一种较安全可靠采取成熟精荚的方法。只要摸索出适宜的条件，刺激后的亲虾可继续培养持续间隔采精。几种对虾电刺激采精的适宜条件为交流电压4～6 V，刺激时间1～2 s[6]，其电压明显低于本文的结果。螯虾具有较厚的甲壳，能较好地阻绝电流，这可能是天空蓝魔需要较高刺激电压的原因。野生型的破坏者螯虾也需要较强的电流刺激才能排出精荚，电压最高可调至55 V、频率40～50 Hz、刺激时间在10 s以内，体重为10.3～155 g[8]。相比野生型的破坏者螯虾，本次试验对人工天空蓝魔进行具体规范：电压45 V、频率32Hz、刺激时间4s，规格体长(6.1±0.8)cm、体重(13.3±1.2)cm，不仅减少了对天空蓝魔螯虾的伤害，且精荚的排出率与野生型的效果相差不多，符合本次试验目的。

值得注意的是，本文采用天空蓝魔亲虾规格较小，大多为初次性成熟的个体。随着年龄和体型的增加，其有效获得精荚的电压数值往往也会增加，因此在电压设定需要考虑雄虾规格的大小[3]。

3.2 天空蓝魔精荚的形态及数目

甲壳动物十足目精荚由精子团、精荚基质及精荚壁组成。天空蓝魔的精荚壁与部分十足目动物不同，如天空蓝魔的精荚壁与红螯螯虾比较接近，皆为管状，横切面为圆形封闭，所不同的是，天空蓝魔精荚壁是呈C字形[9-10]。刀额新对虾的精荚壁也是呈C字形不完全包裹的[11]，而在天空蓝魔中为完全包裹。凡纳滨对虾精荚内精子数量在(12.5±3.9)×106之间[12]，锯缘青蟹精荚内精子数在(2～10)×106之间[13]，天空蓝魔精荚内精子数量在5.2×104～1.13×106个之间，精荚内精子细胞数量相差不大。本次试验天空蓝魔可获取的精荚的最小规格为体长5.2 cm、重量11.6 g。有研究表明精子数量与体长、体质量和精子合格率无显著性相关[14]，与本次试验结果相符。

3.3 精荚再生周期

本次试验最短可间隔7 d对同一尾天空蓝魔再次获得精荚，研究表明，斑节对虾精荚再生时间为15 d，当间隔时间少于6 d时，会导致精荚质量下降[14]。天空蓝魔具体的精荚再生周期有待研究。精荚在排出后的一段时间内具有一定的黏性，把它放到雌性天空蓝魔开放式的纳精囊上。在试验过程中曾多次尝试，但均未发现可以产卵受精的雌性个体。用电刺激获取精荚为人工授精提供了精荚的来源，但是离成功人工授精还有很多工作要做。