消瘀泄浊饮对慢性环孢素肾病大鼠保护作用的机制研究

2019-12-25张培培叶黎青石承乾何贤松叶宝东

浙江中医药大学学报 2019年12期

张培培叶黎青石承乾何贤松叶宝东

1.浙江中医药大学杭州 310053 2.浙江中医药大学附属第一医院

环孢素A(cyclosporine,CsA)是强效钙调磷酸酶抑制剂，被广泛地应用于肾、肝、心脏、骨髓等实体器官移植后抑制免疫排斥反应及自身免疫疾病的治疗。CsA的临床应用显著地改善了实体器官移植的近期存活率[1]，但其肾毒性所引起的慢性环孢素肾病(chronic cyclosporinenephropathy,CCN)已经成为肾移植后功能不全甚至失败的重要原因[2]。间质纤维化是CCN主要的肾脏病理表现。尽管缺乏有效的治疗手段，但大量研究提示转化成长因子（transforming growth factor-β1,TGF-β1）是引起慢性肾脏病患者肾间质纤维化的关键介质[3-4]；同时肾素-血管紧张素系统(reninangiotensinsystem,RAS)的激活则会上调其核心成分血管紧张素Ⅱ(angiotensionⅡ,AngⅡ)表达，加剧肾纤维化的进展[5]。既往研究报道，在CCN中，肾内RAS的激活会上调AngⅡ表达而促进TGF-β1产生，从而加速CCN间质纤维化进展[6-7]。本研究观察消瘀泄浊饮对CCN大鼠Renin、AngⅡ以及TGF-β1表达的影响，探讨消瘀泄浊饮对CCN防治作用及机制。

1 材料

1.1 实验动物雄性SD大鼠40只，体质量(200±20)g，由浙江中医药大学动物实验中心购于中科院上海实验动物中心，实验动物许可证号：SYXK(浙)2013-0184。

1.2 主要试剂和药品消瘀泄浊饮 (生黄芪30g，制大黄 10g，川牛膝 12g，桃仁 12g，地龙 12g，车前草20g)，所含中药均由浙江中医药大学附属第一医院中药房提供；洛汀新(盐酸贝那普利)片（10mg/片）由北京诺华制药有限公司生产,生产批号为国药准字H20030514，成人用量10mg·d-1。成人用量按照60公斤体重计算，大鼠的用药量根据人-大鼠的体表面积的转换系数6.25而得，即每公斤体重的用药量为成人的6.25倍，洛汀新大鼠用药量1mg·kg-1·d-1。各味中药以单蒸水600mL煎煮1h，共煎2次，2次水煎剂混和后，再以旋转蒸发器将各煎剂浓缩。中药浓缩成消瘀泄浊饮药液(0.96g/ml)，4℃装瓶保存。大鼠用药量10ml/kg。环孢素溶液5g/50ml由杭州中美华东制药有限公司生产，批号为国药准字H10930130，用橄榄油配置成3mg/ml环孢素溶液，棕瓶密封，4℃避光保存。大鼠用药量：25mg·kg-1·d-1。低盐饲料由开源动物饲料（常州）有限公司提供（批号 16091902），肾素ELISA试剂盒购自美国R&D公司，免疫组化试剂盒购自TaKaRa公司，PCR逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，PCR引物购自上海生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 主要仪器设备 AU640全自动生化分析仪(OLYMPUS，Japan)，显微镜（Nikon公司），DK-S12型电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司），LEICA彩色病理图像分析系统（LEICA公司，Germany），医用微波炉（Galanz公司，中国），STP12脱水机（MICROM公司），HM335E切片机（MICROM公司），AP280-2包埋机（MICROM公司）。

2 方法

2.1 模型制备、分组及用药方法雄性SD大鼠全封闭无特定病原体(specific pathogen free，SPF)状态下隔离饲养。适应性饲养1周后，随机分为空白对照组、模型组、消瘀泄浊饮组、洛汀新组，每组10只。正常组：上午予橄榄油 10ml·kg-1·d-1经口灌胃，下午予生理盐水10ml·kg-1·d-1经口灌胃。模型组：造模动物上午予CsA30mg·kg-1·d-1经口灌胃，下午予生理盐水10 ml·kg-1·d-1经口灌胃。洛汀新治疗组：造模动物上午予CsA30mg·kg-1·d-1经口灌胃，下午予洛汀新溶液10ml·kg-1·d-1。消瘀泄浊饮治疗组：造模动物上午予CsA30mg·kg-1·d-1经口灌胃，下午予中药10ml·kg-1·d-1。以上药物灌胃时间均为4周。

2.2 检测指标

2.2.1 各组大鼠一般情况和死亡情况观察大鼠精神状态、进食、大小便及体重的变化，以及死亡情况。

2.2.2 血肌酐、尿素氮、尿肌酐、24小时尿总蛋白的检测灌胃完成后分批行麻醉后腹主动脉取血，3000r·min-1离心15min后置于-20℃保存待检，用全自动生化分析仪器检测血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（Urea nitrogen，BUN）、尿肌酐。大鼠处死前一天时转移至代谢笼，禁食不禁水，至次日8时收集尿液，记录24小时尿量，并测定24h尿蛋白(24 hour total urine protein，24hUpro)，计算肌酐清除率（creatinine clearance rate，Ccr）。

2.2.3 肾组织的病理形态学改变取血后处死大鼠，分离左侧肾脏，迅速以10%福尔马林固定备用，取部分组织切片用苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）常规染色，在光学显微镜下观察肾组织的病理形态学的改变。

2.2.4 肾组织Ⅳ型胶原免疫组织化学检查取10%福尔马林固定部分组织常规固定，脱水、石蜡包埋，按二部法进行操作，采用德国LEICA彩色病理图像分析系统对免疫组化染色阳性反应产物进行半定量分析，每张切片光镜(400×)下随机采集5个不重叠视野,棕黄色为阳性染色区。测量棕黄色阳性染色面积，取平均值。并计算出总光密度=∑Area(阳性表达部位)面积×Density（该部位的平均光密度），一个视野的总光密度表示照片内所有阳性表达部位的Area×Density的和。以阳性染色面积和总光密度为参数进行分析。

2.2.5 血清及肾脏组织肾素酶联免疫吸附测定用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法测定血清及肾脏组织肾素水平：依ELISA说明书操作，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（optical density,OD）值，计算样品浓度。

2.2.6 肾组织AngⅡ、TGF-β1mRNA的表达测定用实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-time Quantitative PCR Detecting System，qPCR）检测大鼠肾组织AngⅡ、TGF-β1mRNA的表达，采用Trizol一步法提取组织总RNA，按逆转录试剂盒方法进行qPCR，以β-ACTION为内参基因。PCR引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

2.3 统计学方法采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料用平均数±标准差（±s）表示，多组数据比较采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，One-way ANOVA）。组间两两比较，方差齐性时，采用最小显著性差异法（least-significant difference，LSD）法；方差不齐时，采用Dunnett’s T3检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况和死亡情况的观察对照组大鼠一般状况良好，活动、精神状况及饮食无明显异常。模型组大鼠出现拱背现象，急躁易激惹，饮食减少，大便稀溏，毛发枯黄，精神萎靡，一般情况较差。中药组及洛丁新组拱背现象、毛发光泽度、精神、饮食情况较模型组有改善。死亡情况见表2。

表2 各组大鼠死亡情况Tab.2 Deaths in each group of rats

3.2 各组大鼠Scr、BUN、Ccr、24hUpro的结果较对照组，模型组血 Bun、Scr水平明显升高（P<0.01），Ccr水平显著降低（P<0.01）；较模型组，消瘀泄浊饮组、洛汀新组血Bun、Scr水平明显降低（P<0.01），Ccr水平显著升高（P<0.05）；较对照组，模型组24小时尿蛋白总量显著升高（P<0.01）；较模型组，洛汀新组和消瘀泄浊饮组24小时尿蛋白总量均显著下降（P<0.01），且与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠 Scr、Bun、Ccr、24hUpro(±s)Tab.3 Comparison of Scr,Bun，Ccr and 24h Upro in each group(±s)

注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05Note:Compared with normal control group，**P<0.01；compared with the model group，△△P<0.01,△P<0.05

组别nBun（μmol·L-1）Scr（mmol·L-1）Ccr（ml·Min-1）24hUpro（mg24h-1）对照组模型组消瘀泄浊组洛汀新组9 6 9 6 5.92±1.22 62.61±11.84**38.33±8.93△△47.91±13.33△55.82±4.33 190.19±35.12**114.14±40.19△△134.41±57.86△△0.90±0.21 0.18±0.04**0.33±0.05△0.31±0.06△16.06±3.91 29.80±10.16**16.33±7.37△△18.20±8.46△△

3.3 肾组织光镜检查结果用HE染色法：对照组肾小球结构基本正常，肾小管排列无紊乱，偶有空泡样变性，偶有炎性细胞浸润；模型组肾间质有大量炎性细胞浸润，小管上皮细胞变性、坏死；消瘀泄浊饮组炎性细胞浸润较模型组减轻，肾小管上皮细胞变性程度减轻；洛汀新组有炎性细胞浸润，小管细胞有变性坏死，但均较模型组减轻。见图1。

图1 各组肾组织光镜检查结果（400×）Fig.1 All groups'kidney tissue changes under light microscopic examination(400×)

3.4 各组大鼠肾组织免疫组化检查结果较对照组，模型组IV型胶原(collagen-IV,Col-IV)沉积的阳性面积比例、总光密度明显升高（P＜0.01）。较模型组，消瘀泄浊饮组及洛汀新组组织中阳性面积比例、总光密度明显降低（P＜0.01）。消瘀泄浊饮组及洛汀新较对照组差异无统计学意义。见表4、图2。

表4 各组大鼠肾脏组织Col-Ⅳ阳性染色面积和总光密度（±s,×104）Tab.4 The positive staining area and total optical density of Col-Ⅳin the renal tissues of rats in each group（±s,×104）

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01Note:Compared with normal control group,**P<0.01;compared with the model group,△△P<0.01

组别 n 阳性面积总光密度对照组模型组消瘀泄浊组洛汀新组9 6 9 6 0.30±0.54 5.83±5.97**0.33±0.15△△0.93±1.25△△0.10±0.18 2.22±2.55**0.13±0.08△△0.35±0.57△△

图2 各组大鼠肾组织Col-Ⅳ的表达（400×）Fig.2 The expression of Col-Ⅳ in the renal tissue of the rats(400×)

3.5 各组大鼠肾组织及血清ELISA检测肾素含量结果肾组织中：较对照组，模型组肾素含量显著上调（P<0.01）；较模型素组，消瘀泄浊饮组及洛汀新组肾素含量下调，但只有洛汀新组差异有统计学意义（P<0.05）。血清中：较对照组，模型组肾素含量明显上升（P<0.01）；较模型组，消瘀泄浊饮组及洛汀新组肾素含量明显下降（P<0.05）。见表5。

表5 各组大鼠肾组织及血清中肾素含量(±s)Tab.5 Renin content in the renal tissues and serum of rats in each group(±s)

注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05Note:Compared with normal control group,**P<0.01;compared with the model group,△△P<0.05

组别 n 组织肾素含量(ng·L-1) 血清肾素含量(ng·L-1)对照组模型组消瘀泄浊饮组洛汀新组9 6 9 6 66.38±4.12 80.59±3.45**76.40±3.58 73.75±3.31△420.65±74.03 751±103.67**516.78±106.82△518.34±168.79△

3.6 各组大鼠肾脏组织AngⅡ、TGF-β1mRNA表达情况较对照组，模型组AngIImRNA、TGF-β1mRNA明显升高（P<0.01）；较模型组，消瘀泄浊饮组及洛汀新组AngIImRNA、TGF-β1mRNA 水平明显降低（P<0.01）；且洛汀新组AngⅡmRNA与对照组比较差异无统计学意义。详见表6。

表6 各组的大鼠肾组织中AngIImRNA、TGF-β1mRNA表达情况(±s)Tab.6 Expression of AngIImRNA、TGF-β1mRNA in the renal tissues of rats in each group(±s)

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01Note:Compared with normal control group,**P<0.01;compared with the model group,△△P<0.01

n AngIImRNA 相对定量(2-△△CT) TGF-β1mRNA 相对定量(2-△△CT)对照组模型组消瘀泄浊饮组洛汀新组9 6 9 6 1.08±0.40 7.72±1.36**3.66±2.06△△1.21±0.51△△1.01±0.14 3.38±0.59**2.10±0.38△△2.41±0.43△△#

4 讨论

20世纪80年代以后，CsA广泛运用于器官移植、骨髓移植及免疫性疾病，但其肾毒性是在CsA治疗过程中最常见的副作用之一，其机制与RAS的激活、交感神经兴奋、内皮素生成、氧化应激等相关[8]，共同加速CCN的进展。CsA通过激活RAS增加肾间质纤维化相关因子TGF-β1表达是其影响CCN发生发展的重要通路之一[6-8]。CCN是导致慢性移植肾病的非免疫因素之一,减低或停用CsA并不能改善肾功能，是影响患者在器官移植术后长期存活的一个重要因素。因此发现CCN并及时对CCN患者进行干预，对患者改善预后、提高生活质量具有重要意义。

肾间质纤维化是包括CCN等各种慢性肾脏病发展到终末期阶段的共同病理表现，TGF-β1在肾纤维化疾病中被认为是一个关键的促纤维化介质。目前已经确定的有TGF-β三种亚型，TGF-β1为最常见的亚型，在所有类型的肾脏常驻细胞均可产生[3-4]。TGF-β1结合 TGF-βⅡ型受体(TypeⅡ TGF-βreceptor,TβRⅡ)后，激活 TGF-β1型受体(Type I TGF-β receptor,TβRI)传递细胞内信号，通过磷酸化Smad2、Smad3并与共同性Smad4形成一个低聚物，从而调节靶基因的表达，引起以Col-IV为主的细胞外基质（extracellular matrixc,ECM）沉积，发挥促纤维化作用[4]；而Smad7则竞争性地与活化受体结合，发挥其对TGF-β/Smad通路负性调控作用。研究表明CCN大鼠肾组织TGF-β1、Smad2/3及Smad4表达增加，而通过瑞舒伐他汀治疗可下调上述因子的表达，并延缓CsA引起的肾小管萎缩及间质纤维化[9]。RAS是机体重要的体液调节系统，具有维持电解质、体液的平衡，血压的稳定等作用。而在CCN中，过表达的肾素促进血管紧张素I的生成，从而上调RAS最主要的活性肽AngⅡ表达，引起高血压，刺激炎性或成纤维细胞增生，促进ECM生成及在肾间质内过度沉积，还可介导肾脏氧化应激，导致CCN的进展[5,10]。Yoon等[11]研究发现氯沙坦降低CCN氧化应激，调节Klotho基因表达，达到保护肾脏作用。Kim等[12]进一步研究发现氯沙坦可通过下调骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、TGF-β1的表达来减轻由CCN引起的肾小管损伤、间质纤维化及小动脉病，证实通过降低或阻断AngII作用可抑制TGF-β/Smad通路而延缓CCN进展。

消瘀泄浊饮由补阳还五汤加减化裁而来，由黄芪、川牛膝、桃仁、地龙、制军、车前草组成，笔者在临床上广泛应用于慢性肾衰竭气虚夹瘀浊的病证[13]，能够明显改善慢性肾功能衰竭患者的临床症状，降低BUN及Scr水平，提高Ccr[14]，并能改善UUO模型大鼠BUN、Scr水平，其机制跟下调TGF-β1表达延缓肾间质纤维化进展有关[15-16]。本研究建立CCN大鼠模型，进一步探讨消瘀泄浊饮能否通过调节RAS系统起到延缓CCN纤维化进展。CCN大鼠模型的建立已较为成熟。国外有学者在低盐饮食状态下，成功地制造了CCN大鼠的模型，方法是采用大鼠皮下注射CsA4周[17]。国内学者乔保平等在低盐条件下，用予灌胃大鼠环孢素的办法，造成肾损害模型，摸索了造模环孢素的剂量，以 30mg·kg-1·d-1最显著[18]。学者谭州科等使用环孢素 25mg·kg-1·d-1，4周时造成了典型的环孢素肾病模型[19]。在前期研究中，课题组使用环孢素 30mg·kg-1·d-1，大鼠存活率低，结合相关文献，采取低盐饮食下，以环孢素口服液25mg·kg-1·d-1灌胃4周的造模方法。采用这种方法，模型组肾组织显示肾小管上皮细胞大量变性坏死，间质中有大量炎性细胞浸润，肾间质纤维化明显，表明造模成功。

实验发现较模型组，消瘀泄浊饮及洛汀新能明显改善CCN大鼠Bun、Scr及Ccr，减少24小时尿蛋白，降低血清及肾组织肾素水平，下调肾组织AngⅡ、TGF-β1mRNA表达。实验结果显示，消瘀泄浊饮组肾组织Col-Ⅳ表达明显降低，肾脏组织病理纤维化程度明显改善，表明下调RAS系统相关成分的表达进而抑制TGF-β/Smad信号通路可能是消瘀泄浊饮延缓CCN进展的机制之一。研究结果还显示，消瘀泄浊饮组大鼠死亡率明显低于洛汀新组和模型组，说明中药消瘀泄浊饮能减轻环孢素的整体毒性作用，值得进一步研究。