广东省中山市库蠓形态与分子鉴定

叶雅芳，刘德星，李婷婷，邱德义，刘环宇

蠓科(Ceratopogonidae)是双翅目(Diptera)中种类繁多、分布甚广的体型较小的昆虫，部分刺吸人畜血液的种类被称为吸血蠓，其中库蠓属(Culicoides)是分布最广、种类最多、与人畜关系最密切的吸血蠓之一。库蠓全世界分布，约有1 400多种，在我国分布有347种[ 1-2]。库蠓不但刺吸人畜血液引起虫咬性皮炎和皮肤过敏性症状，而且还是奥柔普西病毒病(Oropouche virus，OROV)、蓝舌病毒(Bluetongue virus, BTV)、施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus, SBV)、等多种人畜病原体的传播媒介[3]。家畜流行病对畜牧业影响巨大，欧洲BTV和SBV的大暴发曾造成巨大的经济损失[4-5]。了解库蠓的种类、分布、吸血特性及病原体携带率是有效预防控制疫病流行和传播的关键，因此库蠓的准确鉴定对于蠓传疾病的研究和防控有着重要的意义。

由于雌蠓才具吸血习性，对疾病的传播具有重要意义，因此雌蠓的分类鉴定尤其重要，但传统形态学鉴定方法是根据成虫外部形态特征以及雄虫的尾器才能进行有效鉴定，而雌虫、幼虫或肢体残缺的虫体难以辩认，且蠓类中有效的形态鉴定特征极少，对近似种的分类鉴定十分困难，从而影响库蠓地理分布及其传播疾病的深入研究[6-7]。近年来，随着研究人员对线粒体DNA的深度挖掘和广泛应用，线粒体DNA已成为昆虫物种分类和分子序列分析的一种有效分子标记，如线粒体COI基因和Cytb基因片段[8-12]。

中山市位于东经113°9′2″至113°46′，北纬22°11′12″至22°46′35″，位于珠江三角洲中部偏南的西、北江下游出海处，处于北回归线以南，热带北缘，光照充足，热量丰富，气候温暖，冬季气候变化缓和，地理条件和气候条件均适合蠓类生长，且目前尚未见到学者系统开展中山市库蠓的调查研究。本研究以台湾蠛蠓Lasioheleataiwana、丛林铗蠓Forcipomyiabessa、美岛裸蠓Atrichopogonformosanus、弯曲阿蠓Alluaudomyiaflexuosa为外群，对2018年4月至2019年3月在中山市不同生境采集的库蠓进行系统的形态学鉴定以及COI基因和Cytb基因序列分析，为研究我国库蠓快速、准确的分类鉴定提供资料，也为进一步研究其种群分布、种群遗传结构及其传播相关疾病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1库蠓标本 本研究所用的104只库蠓(13只雄虫，91只雌虫)为2018年4月至2019年3月采集于中山市不同生境(详细信息见表1)。

表1 12种库蠓的详细信息

Tab.1 Information ofCulicoidesin this study

种名拉丁学名雄♂雌♀采集地GenBank序列号COICytb原野库蠓Culicoides homotomus1♀6MK917544MK917648苏岛库蠓Culicoides sumatrae1♀5MK917542MK917646异域库蠓Culicoides peregrinus1♀4MK917543MK917647琉球库蠓Culicoides actoni3♀4MK917539-917539MK917608-917610残肢库蠓Culicoides imicola2♀5MK896861,917442MK917545,917546连斑库蠓Culicoides jacobsoni1♀4MK917538MK917607抚须库蠓Culicoides palpifer1♂14♀4,5,7MK917477-917491MK917547-917561荒川库蠓Culicoides arakawai9♂8♀1,3,6,7MK917494-917509MK917564-917580环斑库蠓Culicoides circumscriptus1♂1♀2MK917492-917493MK917562,917563尖喙库蠓Culicoides oxystoma10♀4MK917527-917537MK917597-917606霍飞库蠓Culicoides huffi2♂14♀2,4,6,7MK917511-917527MK917581-917596似同库蠓Culicoides similis35♀5,4,7MK917443-917477MK917622-917645

注：采集地1：居民区(康逸豪园)2：办公区(中山海关中山六路院内)3：城中村(三溪村)4：市内公园(紫马岭公园)5：城郊农庄(一鱼六味饭店，有家禽舍)6：林区(大尖山农户鸡舍)7：城郊大学校园(狮头山)

1.1.2主要试剂 血液和组织DNA提取试剂盒(编号：Q5523)购自天根生化科技有限公司，dNTP、rTaq DNA聚合酶等购于大连宝生物有限公司，引物由Invitrogen公司合成。引物序列：

COI基因扩增引物：

LCO1490(5′-GGTCAACAAAATCATAAA-GATATTGG-3′)；

HCO2198(5′-TGATTTTTTGGTCACCCTGGAAGTTTTA-3′)[13]

Cytb基因扩增引物：

Cytb424-449(5′-GCRTAWGCRAAWARRA-ARTAYCAYTCWGG-3′)；

Cytb876-847(5′-ATYTGWCCYCAWGGWA-RWACRTAWCC-3′)[14]

1.2 方 法

1.2.1库蠓采集 根据库蠓的生活习性，选择灯诱法(功夫小帅，24 W，12V，波长365 nm，武汉市吉星环保科技有限责任公司)。在7种不同的生态环境中居民区(康逸豪园)、办公区(中山海关中山六路院内)、城中村(三溪村)、市内公园(紫马岭公园)、城郊农庄(一鱼六味饭店，有家禽舍)、林区(大尖山农户鸡舍)、城郊大学校园(狮头山)布置采样点进行蠓虫收集，每月的上下旬各采集一次。在所选的生境内，选择远离光源干扰和避风的室外场所作为挂灯点，每个采样点挂诱虫灯3盏，光源离地1.5 m，于日落前1 h接通电源，连续灯诱3 h后取出集蠓袋，做好标记，蠓连同集蠓袋放置于-20℃冰箱冷冻致死。

1.2.2库蠓基因组DNA提取 参照文献的方法[15]，挑选形态完整的库蠓，切下翅置于玻片上，把剩余部分浸泡在220 μL含有1%蛋白酶K的组织消化缓冲液(天根公司DNA提取试剂盒)中，56 ℃消化过夜，按试剂盒操作说明从消化液中提取库蠓基因组DNA，提取的DNA置于4 ℃暂存备用。

1.2.3样本处理和形态学鉴定 对消化后的库蠓进行清洗、逐步脱水、切下头部和腹部、将头部的触须、触角，腹部、足摆正后，滴上加拿大树胶(加丁香油)，重新调整摆正，封片，最后制成玻片标本[16]。待研究库蠓根据外部形态特征按照《中国蠓科昆虫》[2]，显微镜镜检鉴定种类，取一侧翅进行拍照。

1.2.4PCR的扩增 分别采用COI基因和Cytb基因通用引物[13-14]进行 PCR 扩增。PCR扩增体系如下：DNA模板3 μL，上、下游引物(10 μL/L)各1 μL/L，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，rTaq酶0.5 μL，加ddH2O补至50 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后再72 ℃延伸10 min。

1.2.5序列测定及分析 1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增情况，并将扩增产物送至上海立菲公司双向测序，测序引物同扩增引物。使用DNAMAN软件，将去除两端引物后的正向序列在GenBank数据库进行比对鉴定物种。

1.2.6COI和Cytb序列分析 将库蠓104条COI序列和Cytb序列上传至GenBank，每条序列及其凭证标本详细信息见表1，并在GenBank中引入85种库蠓656条序列长度658 bp以上的COI序列和2种库蠓234条序列长度300 bp以上的Cytb序列(已剔除未明确到种和同一蠓种的序列差异>2%的序列)，采用自测的台湾蠛蠓、丛林铗蠓、美岛裸蠓、弯曲阿蠓8条COI序列和8条Cytb序列分别作为外群，使用MEGA6.0软件将以上所得的COI序列和Cytb序列，截取出完全重合的序列进行分析，基于Kimura2-parameter 模型，邻接法构建NJ树(自检值设置为1 000次)。

2 结 果

2.1主要形态特征描述 根据104只库蠓头部、翅、腹部、尾器的形态描述进行检索鉴定标本，鉴定结果为原野库蠓(1♀)、苏岛库蠓(1♀)、异域库蠓(1♀)、琉球库蠓(3♀)、残肢库蠓(2♀)、连斑库蠓(1♀)、抚须库蠓(1♂，14♀)、荒川库蠓(9♂，8♀)、环斑库蠓(1♂，1♀)、尖喙库蠓(10♀)、霍飞库蠓(2♂，14♀)、似同库蠓(35♀)12种库蠓(表2、图1)。由表2、图1可知：1)头部：该12种库蠓头部形态特征(复眼是否连接、眼面间柔毛、触须第3节感觉器窝)之间不完全存在差异，不能作为鉴别特征。2)翅：该12种库蠓翅特征(翅面淡、暗斑是否明显、翅臀室淡斑数目、径中淡斑是否覆盖第1 径室基部和径中横脉、翅面大毛所在位置、径5 室淡斑数目、径5 室淡斑位置)和一侧翅图之间均存在差异，可作为鉴别的特征。3)腹部：库蠓雌虫腹部特征(受精囊数目、受精囊形态)之间不完全存在差异，可知库蠓雌虫腹部特征不能作为鉴别的特征。4)尾器：该12种库蠓雄虫尾器形态(阳茎中叶形态、阳茎中叶侧突形态)之间存在很大的差异，因此雄蠓可以根据其尾器形态进行有效鉴定。

图1 12种库蠓一侧翅图Fig.1 Wing of Culicoides

2.2 COI序列分析

2.2.1COI序列构成 104只12种库蠓COI的长度均为658 bp。抚须库蠓、环斑库蠓、似同库蠓、苏岛库蠓4种库蠓COI序列在GenBank中未找到相应序列，为本研究首次获得。从GenBank数据库中引用85种库蠓COI序列656条，采用自测的其它蠓属COI序列有台湾蠛蠓2条、丛林铗蠓3条、美岛裸蠓2条、弯曲阿蠓1条。将以上所得的COI序列对齐，截取出完全重合的序列后，共获得93种库蠓768条长度为612 bpCOI序列。

2.2.2COI序列同源性比对 将本研究所获12种库蠓COI序列与GenBank数据库中的序列进行同源比对，原野库蠓、异域库蠓、琉球库蠓、残肢库蠓、连斑库蠓、荒川库蠓、尖喙库蠓、霍飞库蠓的COI序列相似度皆大于98%，说明该8种库蠓的形态鉴定结果与GenBank数据库中的COI基因序列比对结果一致。抚须库蠓、苏岛库蠓在GenBank中均未收录COI序列，而似同库蠓、环斑库蠓与GenBank数据库中的COI序列相似度小于98%。

2.2.3COI聚类分析 基于COI聚类分析表明(图2)，不同种类蠓间无交叉，且相同种类蠓的不同个体均聚在同一分支下，支持率达到99%以上，仅Bakhoum鉴定的似同库蠓[17]虽聚在同一分支但支持度仅90%。库蠓属与蠛蠓属、铗蠓属、裸蠓属、阿蠓属混在不同支序内，但因支持度低(<20%)，无法说明其亲缘关系，符合关于COI基因不适合进行系统进化关系分析的结论[18]，对上述4属并入库蠓属的现象，在其他昆虫中也有类似的结果[19]。苏岛库蠓与其近似种无害库蠓序列相似度95.24%，低于98%，该两库蠓间无交叉，说明COI基因在不同蠓种间有明显差异，可以用于鉴定和区分近似蠓种。抚须库蠓、霍飞库蠓、荒川库蠓、环斑库蠓该4种库蠓雌虫与其雄虫形态特征之间存在差异，而雌虫COI基因序列与雄虫序列聚在同一分支下且相似度98%以上，说明同一种的雌雄库蠓之间COI基因的差异小于种间差异，可以用于雌虫的种类鉴定。

2.3 Cytb序列分析

2.3.1Cytb序列构成 104只12种库蠓Cytb的长度均为394 bp。原野库蠓、苏岛库蠓、异域库蠓、琉球库蠓、残肢库蠓、连斑库蠓、抚须库蠓、荒川库蠓、环斑库蠓、尖喙库蠓、霍飞库蠓、似同库蠓10种库蠓Cytb序列在GenBank中未找到相应序列，为本研究首次获得。从GenBank中引用2种库蠓荒川库蠓、残肢库蠓Cytb序列248条。采用自测的其它蠓属Cytb序列有台湾蠛蠓2条、丛林铗蠓3条、美岛裸蠓2条、弯曲阿蠓1条。将以上所得的Cytb序列对齐，截取出完全重合的序列后，共获得16种库蠓360条长度321 bpCytb序列用于分析。

2.3.2Cytb序列同源性比对 将本研究12种库蠓的全部Cytb序列与GenBank数据库中的序列进行同源比对，荒川库蠓、残肢库蠓Cytb序列相似度皆大于98%，说明该2种库蠓的形态鉴定结果与GenBank数据库中的Cytb基因序列比对结果一致。其余10种库蠓原野库蠓、苏岛库蠓、异域库蠓、琉球库蠓、残肢库蠓、连斑库蠓、抚须库蠓、荒川库蠓、环斑库蠓、尖喙库蠓、霍飞库蠓、似同库蠓在GenBank中均未收录有Cytb基因序列。

注：♂.雄性库蠓序列；♀.雌性库蠓序列；★.GenBank引用的序列。进化树等边三角形◀的底边长度代表每个物种含有个体数目的多少图2 基于COI构建的NJ树(Kimura 2-parameter模型)Fig.2 Neighbor-jointing tree based on the mitohondrial gene COI sequence

2.3.3Cytb聚类分析 基于Cytb聚类分析表明(图3)，不同种类蠓间无交叉，且相同种类蠓的不同个体均聚在同一分支下，支持率均达到99%，说明Cytb基因在不同蠓种间有明显差异，可以用于鉴定和区分蠓种。库蠓属与蠛蠓属、铗蠓属、裸蠓属、阿蠓属混在不同支序内，但因支持度低(<10%)，无法说明其亲缘关系，说明Cytb不适合进行系统进化关系分析，对上述4属并入库蠓属的现象，与本研究COI聚类分析的研究结果一致。抚须库蠓、霍飞库蠓、荒川库蠓、环斑库蠓雌虫Cytb基因序列与雄虫序列聚在同一分支下且相似度98%以上，说明同一种的雌雄库蠓之间Cytb基因的差异小于种间的差异，可以用于雌虫的种类鉴定。

注：♂.雄性库蠓序列；♀.雌性库蠓序列；★.GenBank引用的序列。进化树等边三角形◀的底边长度代表每个物种含有个体数目的多少图3 基于Cytb构建的NJ树(Kimura 2-parameter模型)Fig.3 Neighbor-jointing tree based on the mitohondrial gene Cytb sequence

3 讨 论

本研究在中山市不同生境采集的抚须库蠓、霍飞库蠓、荒川库蠓、环斑库蠓雄虫可以根据其尾器的形态特征进行有效鉴定，而12种库蠓雌虫仅可从翅部特征的细微差异进行鉴定和区别，特别是近似种，如苏岛库蠓与无害库蠓。线粒体DNA(mtDNA)具有多拷贝、分子量小、母系遗传、突变速度适中等特点，能准确鉴别物种[22]。目前，已有多个研究表明在对蚤目、同翅目和双翅目(摇蚊科、麻蝇科)等昆虫进行序列分析时联合形态学特征以及线粒体DNA(mtDNA)综合分析得到的结果比单独使用线粒体COI基因分析得到的结果更为理想[23-25]。因此，本研究基于形态学特征和COI、Cytb分子标记数据综合分析对12种库蠓进行鉴定，验证了线粒体COI和Cytb基因序列可作为库蠓的分类鉴定和序列聚类分析的有效分子标记，可得到更为准确的种类鉴定和序列分析结果。

库蠓雄虫可以根据其尾器特征进行有效鉴定，而库蠓雌虫有效的形态鉴定特征极少，尤其大多近似种仅可从翅特征的细微差异进行鉴定和区别，例如苏岛库蠓与无害库蠓是近似种，许多形态特征相似，只能根据翅特征进行鉴别：苏岛库蠓翅基淡斑大，向后延伸至臀室基部翅缘，即翅基淡斑与臀室基部淡斑融合，臀室只有2个淡斑；而无害库蠓翅基淡斑与臀室基部淡斑分离，臀室均有3个淡斑，其余形态特征几乎无异[15]，但该2种库蠓COI序列相似度95.24%，低于98%，说明COI基因在近似蠓种间有明显差异，这与COI基因用于其它昆虫近似种的研究结果相似[26-28]，可以用于鉴定和区分近似蠓种，所以该12种库蠓形态学鉴定的结果需要分子鉴定加以补充。本研究组的似同库蠓形态特征与《中国蠓科昆虫》[2]的似同库蠓相一致，而Bakhoum鉴定的似同库蠓[17]与本研究的似同库蠓翅特征不一致，COI序列相似度为88.18%，低于98%；Harrup鉴定的似同库蠓[20]与本研究的似同库蠓COI序列相似度为93.15%，低于98%，且在基于COI构建的NJ树中，Bakhoum鉴定的似同库蠓[17]聚在同一分支的支持度仅90%，其个体间COI序列差异较大，说明Bakhoum[17]、Harrup[20]鉴定的似同库蠓可能不准确；同理，本研究组的环斑库蠓形态特征与《中国蠓科昆虫》[2]的环斑库蠓相一致，而Slama D鉴定的环斑库蠓[21]形态特征与本研究的环斑库蠓不一致，说明Slama D鉴定的环斑库蠓[21]可能不准确，因此上传基因序列到数据库前，应该尽量通过形态学的反复鉴定和确认。在构建的2个基因NJ树中，虽然不同蠓属聚在同一大支，但不同蠓种间无交叉，且相同蠓种的不同个体均聚在同一分支下，支持率达到99%以上，说明COI和Cytb基因只适于蠓虫种级的鉴定。抚须库蠓、霍飞库蠓、荒川库蠓、环斑库蠓雌虫COI基因、Cytb基因序列与雄虫序列聚在同一分支下且相似度98%以上，说明同一种的雌雄库蠓之间COI基因、Cytb基因的差异小于种间的差异，这与COI基因、Cytb基因用于其它昆虫的研究结果相似[29-32]，可以用于雌虫的种类鉴定。

线粒体COI基因和Cytb基因分子标记已应用于多种医学昆虫近似种的鉴定与区别[26-28]，由于分子标记不受性别、早期阶段的形态结构、肢体残缺的虫体、鉴定者专业性的的影响[33]，形态学与分子学相结合的方法鉴别库蠓，可以相互验证，使结果更为准确，为库蠓的鉴别提供了准确高效的方法。

利益冲突：无