云南省梁河县鼠疫疫源地野外鼠形动物嗜吞噬细胞无形体感染调查

张宏泽，朱俊洁，俞 丹，洪汝丹，洪 梅，刘正祥，栗冬梅，尹家祥

人粒细胞无形体病是由嗜吞噬细胞无形体(Anaplasmaphagocytophilum，AP)感染所引起的一种人兽共患病，是常见的蜱传自然疫源性疾病[1-3]。自2006年我国安徽省发现首例HGA患者以来，东北、华北、华南、华中、西北及西南等多地均有HGA患者或疑似患者的报道[4-6]。云南省由于其独特的地形地貌，成为我国多种蜱传疾病的流行区域。梁河县地处云南省西部横断山脉西南端，介于东经98°06′～98°31′、北纬24°31′～24°58′之间，境内海拔高差达1 800 m，有中山、低山、火山锥、台阶地、河谷平坝5种地貌类型，是云南家鼠鼠疫自然疫源地区域，但尚不清楚该疫源地鼠形动物是否有无形体感染。本研究采用巢式PCR对采集自梁河县的野外鼠形动物肝脾样本进行扩增并对扩增产物进行基因序列检测，对阳性样本基因序列进行对比分析，旨在了解云南省梁河县鼠疫疫源地野外鼠形动物嗜吞噬细胞无形体自然感染情况。

1 材料与方法

1.1动物样本采集及抽样 本研究于2015年12月至2016年10月分春、夏、秋、冬四季于梁河县按海拔高度选取了Ⅰ海拔梯度(1 000～1 200 m)、Ⅱ海拔梯度(1 200～1 400 m)、Ⅲ海拔梯度(1 400～1 600 m)及Ⅳ海拔梯度(1 600 m以上)4个海拔梯度，每个海拔梯度段选取2～3个研究样点进行野外捕鼠并记录生境信息。将捕获的665只野外鼠形动物带回实验室进行鼠种鉴定，无菌条件下取肝、脾脏器样本，置于-40 ℃保存备用。应用单纯随机抽样方法抽取407份动物标本(数量少于或等于10只的鼠种全部纳入)进行嗜吞噬细胞无形体检测分析。

1.2 试剂与设备

1.2.1分子生物学检测 磁珠法微量细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(AU19014)与核酸染料Gelview(北京百泰克生物技术有限公司)；DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)和 Nuclease-Free Water(Thermo)；DNA Marker(Biomed)；Agarose(Coolaber)。

1.2.2仪器设备 全自动核酸提取仪AU1001(北京百泰克生物技术有限公司)；核酸浓度测定仪NanoDrop-1000(Thremo)；QuantStudio3 PCR仪(Thremo)；台式高速离心机(AndyBio)；G:Box凝胶成像系统(Syngene)。

1.3 方 法

1.3.1DNA提取 所有样本DNA按照磁珠法微量细胞/组织基因组DNA提取试剂(AU19014)说明书进行操作。

1.3.2引物 根据参考文献[7]，选取无形体属16S rRNA基因巢式PCR通用外侧引物out1：5′-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3′；out2：5′-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3′；与嗜吞噬细胞无形体特异性引物HGA1：5′-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG-3′；HGA2：5′-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3′，由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.3.3PCR检测 先用外侧引物out1和out2对所提取的样本DNA进行扩增，PCR第1轮扩增反应体系为PremixTaq酶12.5 μL、上下游引物各0.5 μL (10 μmol/L)、DNA模板5 μL，加无菌去离子水补至总体积25 μL。扩增条件：95 ℃预变性3 min后，以95 ℃变性30 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸50 s、循环35次，72 ℃总延伸7 min。第2轮反应使用嗜吞噬细胞无形体特异性引物 HGA1和HGA2 进行扩增，反应体系为PremixTaq酶15 μL、上下游引物各0.6 μL (10 umol/L)、取第1轮扩增产物0.5 μL 作为模板，加无菌去离子水至总体积30 μL。反应条件同第1轮。本实验将首份PCR扩增阳性产物送至上海生工生物技术公司测序；通过比对序列将其确定为嗜吞噬细胞无形体，并将此样本扩增产物作为阳性对照。阴性对照模板为无菌去离子水；为避免污染，配置反应体系、PCR扩增及凝胶电泳均在不同实验室进行，阳性对照仅用于电泳检测目的条带位置比较。

1.3.4电泳检测 制备1.5%琼脂糖凝胶后吸取第二轮PCR扩增产物3 μL 进行120 V、45 min电泳；使用凝胶成像系统对胶体成像，并拍照保存；选取单一条带 PCR 扩增阳性产物直接送上海生工生物技术公司测序。

1.3.5PCR阳性产物测序及序列分析 通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)站点，利用BLAST“Sequence Similarity Searching”工具，与GenBank中的无形体基因序列进行相似性比较，序列分析采用DNAStar、MEGA7.0等软件。

1.3.6统计学分析 应用R软件进行统计学分析，采用Chi-square Test、Fisher’s Exact Test比较不同海拔梯度、性别、生境及季节间野外鼠形动物嗜吞噬细胞无形体感染情况，检验水准为α=0.05。

2 结 果

2.1野外鼠形动物感染情况 本次调查共捕获野外鼠形动物3目5科12属17种665只，共抽取野外鼠形动物3目5科12属17种407只进行嗜吞噬细胞无形体检测，总阳性率为3.19%(13/407)；其中有3种野外鼠形动物感染嗜吞噬细胞无形体，即黄胸鼠(Rattustanezumi)、斯氏家鼠(Rattussteini)和大足鼠(Rattusnitidus)，其感染率分别为6%(6/100)、4.94%(4/81)和21.43%(3/14)(见表1)。

对13份野外鼠形动物阳性样本巢式PCR扩增产物进行电泳检测，均得到389 bp左右的目的片段(见图1)，符合预计目标条带。

2.2不同海拔梯度、性别、生境及季节间嗜吞噬细胞无形体感染情况 随着海拔梯度升高，野外鼠形动物感染嗜吞噬细胞无形体有降低趋势，但差异无统计学意义(P=0.219)；不同性别野外鼠形动物感染率无统计学差异(χ2=0.441，P=0.506)；本次检测的所有阳性样本均采集自林地，但不同生境间野外鼠形动物感染率无统计学差异(χ2=0.386，P=0.534)；不同季节野外鼠形动物感染率差异具有统计学意义(P=0.044)，其中春季感染率最高7.53%(7/93)(表2)。

表1 不同种类鼠形动物感染嗜吞噬细胞无形体情况

Tab.1 Infection rate ofAnaplasmaphagocytophilumin different mammals species

鼠形动物种类检测样本数阳性数感染率(%)黄胸鼠10066.00 斯氏家鼠8144.94 锡金小鼠4400 针毛鼠4100 臭鼩鼱3200 毛猬2800 短尾鼩2400大足鼠14321.43青毛鼠900 滇绒鼠900 大绒鼠700灰麝鼩600 树鼩400 长尾大麝鼩300 白腹鼠200 社鼠200 板齿鼠100 合计407133.19

2.316S rRNA基因序列同源性分析 将13份阳性样本的16S rRNA基因序列的测序结果经Megalign对比分析，显示本次调查所有样本16S rRNA基因序列完全一致。使用DNAstar对所测得的序列拼接后进行BLAST，通过与GenBank中收录的部分嗜吞噬细胞无形体相对应的片段进行同源性比较，发现本次调查所得到的基因序列与来自中国东北(GQ412339.1)、俄罗斯(HM366583.1)、浙江(HM439430.1)、吉林(DQ449948.1)、加拿大(HG916766.1)、云南(MF134887.1)及安徽(EF211110.2)的嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因序列同源性为100%；与日本(AB196721.1)、韩国(AF70699.1)及湖北(HM538192.1)的无形体序列同源性分别为98.6%、98.6%及97.9%；而与意大利(EF520690.1)和韩国(GU556626.1)的无形体序列同源性分别为97.6%和96.5%(见图2)。

注：M为DNA marker ；PC为阳性对照 ；NC为阴性对照；BC为空白对照；037-393号为阳性扩增产物。图1 嗜吞噬细胞无形体巢式PCR扩增结果Fig.1 Result of nest PCR for Anaplasma phagocytophilum

表2 不同海拔梯度、性别、生境及季节间嗜吞噬细胞无形体感染情况

Tab.2 Comparison of the infection rate ofAnaplasmaphagocytophilumin different elevation gradients, gender,habitat and seasons

因素检测样本数阳性样本数感染率(%)χ2值P值海拔/m0.219① 1 000～1 20011765.13 1 200～1 40011954.2 1 400～1 60011021.82 ≥1 6006100性别②0.4410.506 雌性19152.62 雄性21183.79生境0.3860.534 林地372133.49 耕地林地交界3500季节0.044① 春季9377.53 夏季7811.28 秋季12010.83 冬季11643.45

注：①Fisher’s Exact Test；②5只鼠形动物未鉴定出性别

图2 嗜吞噬细胞无形体16S rRNA序列的同源性比较Fig.2 Homology analysis for 16S rRNA gene of Anaplasma phagocytophilum

注：△的样本为本次检测的梁河样本图3 嗜吞噬无形体16S rRNA基因序列进化分析Fig.3 Phylogentic tree based on 16S rRNA gene of Anaplasma phagocytophilum

2.416S rRNA基因序列进化分析 本次调查得到的13份阳性样本均检测到的389 bp左右的16S rRNA基因序列，并与GenBank收录的部分无形体16S rRNA基因序列一起采用MEGA7.0软件进行进化分析，进化分析采用Maximum Likelihood方法推测(见图3)。进化分析表明本次调查所有阳性样本基因序列与中国东北(GQ412339.1)、俄罗斯(HM366583.1)、浙江(HM439430.1)、吉林(DQ449948.1)、加拿大(HG916766.1)云南(MF134887.1)、安徽(EF211110.2)等地不同宿主动物(如鼠、蜱等)感染无形体株聚在同一分支。与日本(AB196721.1)及韩国(AF70699.1)的嗜吞噬细胞无形体株具有较高的同源性，同属一个大分支，但相距较远。而湖北(HM538192.1)边缘无形体(A.marginale)、韩国(GU556626.1)牛无形体(A.bovis)、意大利(EF520690.1)中央无形体(A.centrale)则处于外围。

3 讨 论

嗜吞噬细胞无形体是一种经蜱叮咬传播的细胞胞浆内专性寄生菌，能侵染人末梢血中性粒细胞引起人粒细胞无形体病，其主要的传播媒介为全沟硬蜱(Ixodespersulcatus)，可感染野鼠、狗、羊、马及牛等宿主动物[8-11]。本次调查检测嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因序列是由于该基因序列的高变区具有细菌属、种的特征，尤其是为发现细胞内专性寄生菌提供了迅速精准的方法。本次实验采用巢氏PCR方法对云南省梁河县野外鼠形动物进行检测，发现该地区野外鼠形动物嗜吞噬细胞无形体感染率为3.19%，提示梁河县为人粒细胞无形体病的自然疫源地。随着海拔梯度升高，野外鼠形动物感染嗜吞噬细胞无形体有降低趋势，虽然没有统计学意义，但这一结果与我们前期在海拔较高的剑川县(2250 m以上)和玉龙县(2 400 m以上)捕获到的野外鼠形动物嗜吞噬细胞无形体感染率较低相一致(剑川县感染率为0，玉龙县感染率为0.36%)，这也可能与生境特点、鼠种动物构成情况等有关，有待进一步深入研究。野外鼠形动物不同的性别及其栖息环境间嗜吞噬细胞无形体感染率无统计学差异，说明这两个因素与野外鼠形动物感染嗜吞噬细胞无形体无关；不同季节野外鼠形动物嗜吞噬细胞无形体感染率差异具有统计学意义，但冬春季感染率较高而夏秋季较低，这一现象与媒介蜱的季节性消长并不一致，需进一步调查研究阐释该现象出现的原因。

经序列同源性分析，本次实验检出的13份嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因序列与我国云南、浙江、吉林及俄罗斯、加拿大等地检出的7个相对应序列同源性为100%，确证本次研究测得的序列为嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因序列。通过与日本等国家进行嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因序列同源性比较发现所测序列与日本(AB196721.1)及韩国(AF70699.1)嗜吞噬细胞无形体基因序列具有较高的同源性，但不同地区嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因序列存在小幅度的变异，这可能是由于不同地区嗜吞噬细胞无形体宿主动物或媒介生物不同所致。

进化分析显示所测序列与安徽省某医院感染嗜吞噬细胞无形体患者血中检测的序列(EF211110)属同一分支，提示梁河县境内嗜吞噬细胞无形体存在对人致病的可能[4]。此外，无形体属其它成员湖北(HM538192.1)边缘无形体(A.marginale)及意大利(EF520690.1)中央无形体(A.centrale)虽与嗜吞噬细胞无形体相距较远，但同属一个大分支，说明嗜吞噬细胞无形体与边缘无形体(A.marginale)及中央无形体(A.centrale)亲缘关系较近。

本次调查表明云南省梁河县野外鼠形动物存在嗜吞噬细胞无形体低度感染，但尚不清楚无形体株是否能对人类致病以及与鼠疫发生和流行是否有关系，有必要进行深入研究。

(大理大学魏兆飞、赵秋芳、徐丹丹、周芸、王梦迪参与了现场标本采集工作，在此表示感谢！)

利益冲突：无