空肠弯曲菌VI型分泌系统结构特征和菌株中分布

梁 昊，顾一心，周贵兰，张建中，张茂俊

食源性弯曲菌感染被认为是发展中国家和发达国家细菌性腹泻的主要原因，是重要的公共卫生问题[1-3]。最近的研究显示，在北京的腹泻病例中，弯曲菌的分离率在主要细菌病原体中排名第3[3]。在食源性弯曲菌的感染中，空肠弯曲菌占主导地位，其感染也与罕见的感染后症状有关，如反应性关节炎和吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barré syndrome, GBS)等，在少数情况下，空肠弯曲菌感染可导致患者死亡。空肠弯曲菌可在从哺乳动物到鸟类的多种动物宿主中发现[4-5]，包括牛、猪、羊等家畜动物，鸡、鸭等家禽动物以及乌鸦、鸽子等鸟类。空肠弯曲菌大量存在于这些自然宿主中，尤其是家禽中[6]。由于粪-口感染途径的“高效”，一旦弯曲菌感染到养殖场的家禽中，几天内感染即可蔓延到整个群体[7]。在屠宰过程中，动物胴体也可能会受到空肠弯曲菌污染，导致家禽产品在零售过程中的污染，这些被污染的家禽产品通常被认为是造成人群空肠弯曲菌感染的主要原因[8]。

空肠弯曲菌发病机制尚不完全清楚，已鉴定出的毒力因子包括鞭毛蛋白(flaA)、黏附相关蛋白(cadF)、脂蛋白(ceuE)、细胞毒素(cdtB)和脂寡糖唾液酸转移酶基因(cstII、cstIII)等[9-10]。过去的研究表明，VI型分泌系统(Type VI secretion system, T6SS)在霍乱弧菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌等病原体的毒力中发挥重要作用[11-13]。这些细菌可以在许多生态位中定居，包括土壤、海洋环境、植物、无脊椎动物、脊椎动物和哺乳动物，这意味着T6SS可能在这些不同的生态位中发挥作用，在1/4以上的变形杆菌中发现了T6SS基因簇[14]。这些T6SS基因簇通常在不同物种之间具有不同的组成，但通常包含至少13个编码注射装置基本元素的核心基因[15]。全基因组测序显示，在空肠弯曲菌中，完整的T6SS基因簇的存在与hcp(溶血素协同蛋白)基因的存在密切相关[16]。空肠弯曲菌T6SS在毒力方面具有多种作用，包括细胞粘附、对红细胞的细胞毒性和小鼠定植[17]。

然而，T6SS基因簇在中国空肠弯曲菌的分布和结构特征尚不清楚。本研究旨在通过全基因组分析来对其加以明确。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1测序菌株 本实验室中保存的35株空肠弯曲菌，其中12株从鸡分离，23株从病人(包括腹泻病人和GBS病人)分离。同时从NCBI数据库(www.ncbi.org/)中下载了鸡、鸟类、牛、羊等不同来源的17株国外菌株(表1)。

表1 菌株基本情况

Tab.1 Summary of isolates

菌株名称来源分离地区Accession Number∗BJ-CJD-101腹泻病人北京ARWV00000000BJ-CJD120腹泻病人北京LISM00000000BJ-CJD39腹泻病人北京LISI00000000BJ-CJD55腹泻病人北京LISJ00000000BJ-CJD63腹泻病人北京LISK00000000BJ-CJD70腹泻病人北京LISL00000000BJ-CJGB-96G25GBS病人北京ASXL00000000BJ-CJGB95377GBS病人北京ASXK00000000BJ-CJGB96114GBS病人北京ASXM00000000BJ-CJGB96299GBS病人北京ASXN00000000BJ-CJH18鸡北京LISN00000000BJ-CJH23鸡北京LISO00000000BJCJH13鸡北京BJCJH15鸡北京HB-CJGB-LCGBS病人河北ASXO00000000HB-CJGB-LLGBS病人河北ATBJ00000000HB-CJGB-LXCGBS病人河北ATBL00000000HB-CJGB-QYTGBS病人河北ATBM00000000HB-CJGB-XWMGBS病人河北ATBN00000000HB-CJGB-ZBGBS病人河北ATBR00000000HB-CJGB-ZHXGBS病人河北ATBS00000000HB-CJGB-ZXGBS病人河北ATBT00000000HBCJH3鸡河北HBCJH5鸡河北HN-CJD07035腹泻病人河南ARYE00000000ICDCCJ07001GBS病人吉林CP002029ICDCCJ07002腹泻病人吉林APNP00000000ICDCCJ07004腹泻病人吉林APNQ00000000JL-CJHLIU1-1鸡吉林LISQ00000000SH-CJD11C664腹泻病人上海LISP00000000ZJCJHD11鸡浙江ZJCJHD13鸡浙江ZJCJHD7鸡浙江ZJCJHE2鸡浙江ZJCJHE7鸡浙江CJJ5070鸡芬兰CCXG00000000ATCC-35925鸟类瑞典CP020045P10-2209鸟类日本JYEC01000000P5-2209鸟类日本JYEB01000000MTVDSCj20鸡美国CP008787.1F15M00601牛美国MOUO00000000F15M00603F23牛美国MOUM00000000M00214牛美国MOVP00000000F15M01909羊美国MOTW00000000F15M01918羊美国MOTV00000000OD267鸡美国CP014744RM1285鸡美国CP012696WP2202鸡美国CP014742YH001牛美国CP010058YH002牛美国CP020776RM1221鸡美国CP000025ZP3204鸡美国CP017856

*空白部分菌株尚未获得GenBank号

1.1.2主要试剂 菌株培养：Karmali CAMPYLOBACTER AGAR BASE(OXOID，英国)，脱纤维羊血(蓝博睿生物，北京)；菌株鉴定用试剂：2×EasyTaqPCR Super mix(全式金生物技术公司，中国)，Trans 2K DNA Marker(全式金生物技术公司，中国)，Regμlar Agarose G-10琼脂糖(BIOWEST公司，法国)，Gel-Red染料(BIOTIUM公司,美国)；DNA提取：Wizard Genomic DNA试剂盒(Promega，美国)

1.2 方 法

1.2.1菌株培养和DNA提取 将保存在-80 ℃的菌株复苏在含有5%脱纤维羊血的Karmali培养基上，置于37 ℃三气培养箱(5% O2、10% CO2、85% N2)中培养48 h，为保证菌株纯度，所有菌株均进行三代单克隆传代培养。将培养好的菌株使用Wizard Genomic DNA试剂盒按说明书进行菌株的DNA的提取。

1.2.2菌株基因组测序 将菌株DNA使用ND-1000分光光度计(Nanodrop，美国)进行浓度和纯度测定，合格样品浓度≥50 ng/μL和总量>20 μg，OD260/OD280值在1.6～1.8之间，并且琼脂糖凝胶电泳检查，显示一条清晰的核酸带。将提取的DNA样本送至武汉华大基因科技有限公司做高通量测序，通过Hiseq 2000测序平台进行pair-end双端测序。测序数据处理使用软件fastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)去掉低质量reads，然后使用SOAPdenovo v2.04 (http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html)软件对高质量reads组装成scaffolds，并用SOAPaligner将reads和scaffolds比对，进行单碱基校正。

1.2.3系统发育构建 采用最大似然法(maximum likelihood, ML) 基于核心基因组构建系统发育树。首先，基于全基因组SNPs分析的结果，去掉全基因组中非核心基因和间隔区的SNPs，然后通过Gubinns[18]软件去重组，最终得到高质量SNPs，将这些SNPs位点接在一起形成一条SNPs序列。系统发育树通过FastTree v2.1.10[19]软件的GTR模型构建，进行1 000次bootstraps校验。

1.2.4T6SS基因簇结构分析 结合过去研究[15]，在毒力因子数据库(Virulence Factor Database, VFBD)[20]中获得T6SS相关的基因序列组成本地数据库，并将本研究中获得菌株序列通过Blast软件[21]进行搜索，分析各菌株中是否含有T6SS基因簇，以及其结构特征。同时，将获得的T6SS基因簇与与鸡螺杆菌和简明弯曲菌的T6SS基因簇(Accession Number: JXTW00000000和CP000792)进行比较，使用GSDS v2.0软件[22]展示分析结果。

2 结 果

2.1基因组测序及组装 本研究所涉及的菌株除过去已经发表外，拼接组装后空肠弯曲菌的Scaffold数量在9～76个之间，平均长度在23～110 kb，最大长度为172～572 kb，基因组整体长度在1.5～1.9 Mb之间，GC含量30.05%～30.48%，长度和GC含量均符合空肠弯曲菌基因组特征。

2.2基因组序列系统发育分析 将基因组上经过去重组后所有SNP位点根据位置按不同菌株内碱基状态连成一条序列，使用FastTree(bootstrap 1000)软件对52株空肠弯曲菌使用最大似然法构建系统发育树。通过去重组的步骤，可将重组引入的SNP去掉，剩下的位点则是菌株竖向遗传的信号，通过这些位点能够得到菌株间进化关系，由此可获得空肠弯曲菌的系统发育关系(如图1)。根据系统发育树中各菌株遗传距离， 52株空肠弯曲菌被分为6个种群分支(Clade 1～6)，分别对应了不同来源的菌株，依次为鸟类来源分支、鸡来源分支1、牛来源分支、临床病人分离菌株分支、混合来源分支和鸡来源分支2。其中，除Clade 4外，其他clade中也弥散分布着临床病人分离菌株。在混合来源分支中，包含了鸡、羊、牛和临床病人分离菌株等多种来源的菌株。

2.3空肠弯曲菌T6SS基因簇结构特征 通过比对长度大约为14 kb的空肠弯曲菌T6SS基因簇序列，发现14个基因，其中impH/vasB、impG/vasA、impC、impB、vasD/lip、impJ/vasE、impK/ompA/vasF/dotU、impL/vasK/icmF、hcp等9种基因为目前已经确认的主要功能基因[23]。同时与与鸡螺杆菌和简明弯曲菌的T6SS基因簇序列进行比较，发现空肠弯曲菌T6SS基因簇与其具有某些相同的基因，但是基因的排列有显著差异(图2)。

2.4T6SS基因簇在空肠弯曲菌菌株中的分布 通过对空肠弯曲菌菌株的T6SS基因簇9种主要基因的存在/缺失的综合分析，结果表明，有36.5%(19/52)的菌株含有T6SS基因簇，且所有菌株中的T6SS基因簇的结构完整，这些菌株只分布在Clade 5和Clade 6两个分支中(图3)。

图1 空肠弯曲菌基于基因组SNP的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of Campylobacter jejuni based on SNP

图2 3种细菌T6SS基因簇结构Fig.2 T6SS gene cluster structure of three bacteria species

图3 T6SS基因簇在空肠弯曲菌菌株中的分布Fig.3 Distribution of T6SS in the population of Campylobacter jejuni

3 讨 论

随着第二代测序技术的广泛使用，基于基因组数据的遗传分析和种群分析越来越多应用于病原微生物领域，截止2019年1月份，公共数据库中(如NCBI、Patric和pubMLST databases等)全基因组测序数据弯曲菌数量已经超过24 000株。本研究通过分析本实验室测定的中国空肠弯曲菌菌株和国际已发表的空肠弯曲菌的基因组数据，通过系统发育树的构建获得空肠弯曲菌的菌株分群，并对空肠弯曲菌的T6SS基因簇结构进行分析。结果发现，在空肠弯曲菌种内T6SS基因簇结构保守，基因的排列和组成非常稳定，而与其他弯曲菌种(简明弯曲菌)和同为ε变形菌门的螺杆菌属(鸡螺杆菌)菌的T6SS基因簇进行比较，发现不同种之间T6SS基因簇的基因排列组合多样化，但均包括hcp等9种主要功能基因，保证T6SS功能的完整性。

T6SS与细菌的致病性、竞争优势和对环境扰动的适应能力密切相关。对空肠弯曲菌T6SS的研究表明，T6SS失活导致对细胞的粘附和侵袭减少，并且T6SS缺陷型空肠弯曲菌不能有效地建立持续定植[17, 24]，而T6SS标志蛋白溶血素共调节蛋白(Hcp)的高表达则显著增强了这一过程。在不同的应激条件下，T6SS也与细菌的生长、运动和存活有关[25]。尽管有研究表明携带T6SS的菌株可能与选择性的靶向蛋白菌为共生体，以促进其在定植中竞争优势，但T6SS的作用和功能仍有待阐明[26]。

本研究首次分析中国空肠弯曲菌携带的T6SS基因簇的结构，系统发育分析显示，在鸡来源菌株的分支内(Clade 2和Clade 6中国菌株有83.3%(10/12)携带T6SS基因簇，其可能与中国菌株的生态位显著相关。

基于T6SS基因簇的系统发育分析显示鸡源菌株高度集中分布在同一个进化分支中，提示含有T6SS的空肠弯曲菌在鸡肠道中定植具有优势；而含有T6SS的临床病人分离菌均存在鸡来源菌株的进化分支中，提示这些病人的空肠弯曲菌感染源可能与鸡相关，提示T6SS基因簇分析对于的公共卫生中的病原菌溯源有重要意义。

利益冲突：无