虎杖苷与顺铂联合增强卵巢癌SKOV3细胞的凋亡作用

孙雅，赵咏梅，齐光照，李婷婷，孟海阳，朱振峰

论著

虎杖苷与顺铂联合增强卵巢癌SKOV3细胞的凋亡作用

孙雅，赵咏梅，齐光照，李婷婷，孟海阳，朱振峰

考察虎杖苷和顺铂联合给药对人卵巢癌 SKOV3 细胞增殖及凋亡的作用机制。

SKOV3 细胞分为虎杖苷和顺铂分别及联合给药组，采用 MTT 法检测对细胞增殖抑制的影响；流式细胞仪检测细胞的凋亡率，并观察细胞晚期凋亡（48 h）的形态学变化；Western blot 检测凋亡蛋白和线粒体通路相关蛋白的表达水平。

MTT 结果显示SKOV3 细胞在虎杖苷和顺铂联合给药后明显降低细胞存活率，且呈时间和浓度依赖性；单克隆形成实验结果显示虎杖苷与顺铂联合给药抑制细胞增殖的能力增强；AnnexinV-FITC 单染检测细胞凋亡率显示，与顺铂给药组相比，联合给药组细胞凋亡率增加 11.5%；Western blot 检测结果表明联合给药组与顺铂单药给药组相比，凋亡蛋白 cleaved PARP、cleaved caspase-9 的表达均增强；线粒体凋亡相关蛋白 Bax 升高，Bcl-2 降低。

虎杖苷和顺铂联用能增强顺铂对细胞增殖的抑制作用，促进细胞凋亡，初步阐明联合给药的抗癌机制是通过线粒体凋亡途径所介导。

顺铂； 细胞凋亡； 丝裂原激活蛋白激酶类； 虎杖苷

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，且致死率较高。美国国立癌症研究院（NCI）调查显示，卵巢癌的致死率约占女性生殖系统肿瘤死亡率的一半[1]。目前，对卵巢癌的手术治疗尚不十分成熟，因为卵巢癌极易发生转移，虽然以铂类药物为主的化疗能在一定程度上弥补手术治疗的局限，但由此引发的化疗耐药问题已成为卵巢癌治疗的难题。

随着近年来对中药抗癌疗法的深入研究，天然来源的抗癌化合物越来越受到关注。虎杖苷是一种天然的多酚类化合物，主要存在于虎杖这一传统中草药中，目前已收录于《中国药典》[2]。研究表明，虎杖苷具有抗心血管疾病、抗氧化、抗炎、防治肿瘤、诱导细胞凋亡及保护中枢神经系统等广泛的药理学活性。其中，虎杖苷因对多种恶性肿瘤具有独特抗肿瘤作用而备受关注。已有研究表明虎杖苷能够诱导急性单核细胞白血病细胞凋亡[3]；诱导肺癌细胞的增殖周期停滞，诱发其凋亡[4]；还通过上调 Bax/Bcl-2 蛋白的比例和减弱 β 反应蛋白信号抑制骨肉瘤细胞增殖[5]。迄今为止，虎杖苷抗卵巢癌研究报道较少。本研究旨在探索虎杖苷能否增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，从而减少化疗耐药的问题。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 虎杖苷购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号D1713186，纯度≥ 98%；MTT 粉末和二甲基亚砜购自广州赛国生物科技有限责任公司；Annexin V-FITC 染色细胞凋亡检测试剂盒和 JC-1 试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；所有一抗抗体均购自美国 Cell Signaling Technology 公司；顺铂和 Hoechst33258 染色液、小鼠抗 β-actin、山羊抗兔 IgG、山羊抗小鼠 IgG 均购自上海碧云天生物技术公司。

1.1.2 细胞 人卵巢癌细胞系 SKOV3 购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.1.3 主要仪器 311 型气套二氧化碳培养箱购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；CKX41 倒置显微镜购自日本 Olympus 公司；Spectra Max Plus 384 酶标仪和 ImageXpress 高内涵成像系统购自美国 Molecular Devices 公司；BD C6 流式细胞仪购自美国BD 公司；TS-2000A 脱色摇床购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Mini-Protean@Tetra 电泳槽、Mini Trans-Blot 转印槽和 ChemiDOCTMXRS+分子成像系统购自美国 Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将 SKOV3 细胞以适量浓度分别接种于培养瓶中，分别加入含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养基，置于 37 ℃、5% CO2及 95% 相对湿度的培养箱中培养。细胞呈贴壁状态生长，每周传代 2 ~ 3 次，用 0.25% 胰酶消化 2 ~ 3 min 传代。

1.2.2 MTT 法 取对数生长期的 SKOV3 细胞，0.25% 胰酶消化后制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为 5 × 104个/ml，每孔接种 100 μl，培养24 h。设置不同浓度的虎杖苷（10、20、40、60、80、100 μmol/L）6 个剂量组，对照组为RPMI1640培养基；顺铂 5 μmol/L 与以上 6 个不同剂量的虎杖苷联合作用，对照组为顺铂（5 μmol/L）。每组各设 3 个复孔，给药后继续培养 24 和 48 h。每孔加 20 μl MTT 继续培养 4 h。弃原液，每孔加 150 μl DMSO，振荡器振荡 10 min，以 570 nm 为检测波长，630 nm 为参照波长，用酶标仪检测各孔的吸光度（），按下列公式计算不同浓度药物作用后肿瘤细胞存活率：细胞存活率（%）=（实验组/对照组）× 100%。用同样的方法设置 5 个不同浓度的顺铂（1.5、3、6.25、12.5、25 μmol/L）给药组，对照组为RPMI1640 培养基，给药后继续培养24 和 48 h，计算细胞存活率。

1.2.3 单克隆形成实验 取对数生长期的 SKOV3 细胞，调整细胞密度为（4 ~ 5）× 102个/ml，每孔 2 ml 接种于 6 孔培养板中，在培养箱中培养至细胞贴壁，弃去原有的培养液，分别加入虎杖苷10 μmol/L，虎杖苷 20 μmol/L，顺铂2.5 μmol/L，虎杖苷10 μmol/L+ 顺铂2.5 μmol/L以及虎杖苷20 μmol/L+ 顺铂2.5 μmol/L，RPMI1640 培养基组作为空白对照组，继续培养 48 h 后撤去加药的培养基，换成正常的新鲜培养基放于 37 ℃、5 % CO2孵箱中继续培养，且每隔 2 ~ 3 天换液，并于光学显微镜下观察克隆的形成。大约 15 d后，6 孔板中出现肉眼可见的克隆时终止培养，弃去培养液，用每孔 1 ml 的 PBS 清洗 2 次，每孔加 1 ml 的 4% 多聚甲醛固定 30 min，弃去固定液，用PBS 清洗 2 次。每孔加入 1 ml 结晶紫染色液染色20 min 左右，然后用 PBS 缓慢洗去染色液，置于空气中干燥后拍照处理。

1.2.4 Hoechst33258 观察细胞核形态 SKOV3 细胞 1 × l05个/孔接种于 96孔板，置于 37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养，24 h 后加入虎杖苷20 μmol/L 以及虎杖苷20 μmol/L+ 顺铂5 μmol/L，同时设定终浓度< 0.1%（v/v）的 DMSO 为溶剂对照组，作用24 h 后，取出用 PBS 清洗细胞 2 次，然后用 4% 多聚甲醛固定 30 min，用 PBS 清洗两次，接着每孔加入 200 μl Hoechst33258 染液，终浓度为5 μg/ml，37 ℃避光染色 30 min。染色结束后用 ImageXpress 高内涵成像系统进行拍照。

1.2.5 AnnexinV-FITC测定细胞凋亡 将对数生长期的 SKOV3 细胞接种于 6 孔板中，培养24 h；按照实验需要将细胞分为不加药组、虎杖苷80 μmol/L组、顺铂5 μmol/L组、虎杖苷80 μmol/L+ 顺铂5 μmol/L组。继续培养48 h，0.25% 胰酶消化，1000 r/min 离心 5 min。收集细胞，PBS洗两遍，加入 500 μl binding buffer 重悬细胞；加入 5 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育 20 min；流式细胞仪检测，激发波长为 488 nm，发射波长为 530 nm。

1.2.6 Western blot 检测虎杖苷与顺铂联用对凋亡信号通路的影响 收集总细胞，提取总蛋白，将提取到的蛋白样品用 BCA 法进行相对定量，将各组蛋白含量调至相同浓度；按 Western blot 常规操作，用 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），通过半干转膜法将蛋白转移至 PVDF 膜上，5% 脱脂牛奶封闭后结合一抗（抗体稀释比均为 1:1000），4 ℃孵育过夜；次日洗涤后结合二抗（抗体稀释比 1:5000），经增强化学发光法显影、定影，以 β-actin 为内参照，用 ImageJ 软件测定各组蛋白的灰度值，除以内参蛋白 β-actin 的灰度值，所得结果为各蛋白的相对值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 虎杖苷与顺铂联用对 SKOV3 细胞生长的影响

2.1.1 MTT 检测细胞活性 虎杖苷单独用药和顺铂单独用药对卵巢癌SKOV3细胞 24、48 h 的细胞存活率比较如图 1A所示；24 h 的虎杖苷、顺铂、虎杖苷+顺铂联合组的 IC50分别为（257.3 ± 5.9）、（14.4 ± 2.7）、（190.5 ± 7.3）μmol/L，CI50= 1.08 ± 0.2，CI ≤ 1.1，为叠加作用；48 h 的虎杖苷、顺铂、虎杖苷+ 顺铂联合组的 IC50分别为（175.7 ± 6.3）、（8.8 ± 2.1）、（13.8 ± 4.5）μmol/L，CI50= 0.68 ± 0.14，CI < 0.8，为中度协同作用（图 1B）。结果表明虎杖苷与顺铂联合作用 48 h 对抑制 SKOV3 细胞生长有协同作用。

图 1 虎杖苷与顺铂联用对SKOV3 细胞生长的影响（A：MTT 法检测SKOV3 细胞经虎杖苷和顺铂分别作用后的存活率；B：MTT 法检测SKOV3 细胞经虎杖苷与顺铂联用后的存活率，与虎杖苷组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；C：SKOV3 细胞经虎杖苷、顺铂、虎杖苷+ 顺铂组处理48 h 后的单克隆形成）

Figure 1 The survival rate of SKOV3 after treated with different concentrations of polydatin and cisplatin [A: MTT assay of cell viability of SKOV3 cells were treated with different concentrations of polydatin and cisplatin; B: MTT assay of cell viability of SKOV3 cells were treated with polydatin and cisplatin,*< 0.05 and**< 0.01, compared to polydatin group; C: SKOV3 cells were treated with different concentrations of polydatin and cisplatin (48 h) and colony formation was assessed by staining with crystal violet]

1：空白对照组；2：顺铂 5 μmol/L；3：顺铂 5 μmol/L + 虎杖苷 20 μmol/L；4：顺铂 5 μmol/L + 虎杖苷 40 μmol/L；5：顺铂 5 μmol/L + 虎杖苷 80 μmol/L

Figure 2 The influence of polydatin on apoptosis of SKOV3 cells induced by cisplatin (A: SKOV3 cells were incubated with polydatin and cisplatin for 24 h, observed using a confocal microscopy; B: SKOV3 cells were pretreated with polydatin and cisplatin for 48 h, and apoptosis rates were analyzed by flow cytometry; C: The expression levels of PARP, cleaved PARP, caspase-9, cleaved caspase-9 were detected by Western blot; D: The expression levels of Bax and Bcl-2 in SKOV3 cells after treated with polydatin and cisplatin, were detected by Western blot;*< 0.05 and**< 0.01, compared to non-treated control)

2.1.2 单克隆形成实验检测细胞增殖抑制作用 图1C结果显示虎杖苷与顺铂联合作用后对SKOV3 细胞增殖的抑制作用增强。虎杖苷单独作用卵巢癌细胞的抑制增殖作用不甚显著，但当其与顺铂（2.5 μmol/L）联用时，20 μmol/L 的虎杖苷明显抑制细胞增殖。

2.2 虎杖苷与顺铂联用对 SKOV3 细胞凋亡的影响

2.2.1 免疫荧光实验检测细胞核形态 核皱缩是细胞凋亡前期的一个明显标志。虎杖苷20 μmol/L 浓度作用于卵巢癌 SKOV3 细胞后，可见细胞核形态变化不大，几近于正常细胞，说明虎杖苷单独作用对 SKOV3 细胞形态影响较小，但与顺铂联合作用后出现细胞核缩小、染色质固缩等形态变化（图 2A）。说明虎杖苷与顺铂联用有增强卵巢癌 SKOV3 细胞核损伤的作用。

2.2.2 AnnexinV-FITC 检测细胞凋亡率 空白对照组凋亡率为（1.9 ± 2.5）%，虎杖苷组凋亡率为（11.5 ± 3.6）%，顺铂组凋亡率为（16.1 ± 3.1）%，虎杖苷+ 顺铂组凋亡率为（27.6 ± 4.5）%，联合作用组与单独用药组的差异有统计学意义（< 0.05）（图 2B）。

2.2.3 Western blot 检测凋亡相关蛋白 caspase 家族蛋白以及线粒体蛋白Bax/Bcl-2 表达 Western blot检测各目的蛋白的表达，虎杖苷与顺铂联合作用 SKOV3 细胞后凋亡蛋白 cleaved PARP、cleaved caspase-9 的表达均较对照组增强（图 2C）。虎杖苷与顺铂联合组线粒体凋亡相关蛋白 Bax 较对照组有升高，Bcl-2 较对照组有降低（图2D）。说明虎杖苷与顺铂联用对线粒体凋亡通路有重要影响。

3 讨论

卵巢癌的化疗耐药及复发转移是世界医学界待攻克的一大难题，需要研究新药物和新的治疗策略来改善卵巢癌的预后。许多研究表明，中药成分开发正在成为发现抗癌药物的新方法[6]。中药虎杖系蓼科植物，具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰等功效。其核心成分是虎杖苷，在肿瘤治疗方面具有较高的药用价值[7]。我们的研究表明虎杖苷能增强卵巢癌细胞对顺铂的药物敏感性，两者联用具有协同作用，能使细胞凋亡增强。

细胞凋亡是一种程序性死亡，是引起癌细胞死亡的一种重要方式。凋亡过程涉及多种信号传导途径的调控，目前已证明的有线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径[8-9]。其中线粒体在细胞凋亡中起着决定性作用，包括：激活细胞色素 C、释放 caspase 家族蛋白、丧失电子转移功能、使线粒体跨膜电位降低以及影响 Bcl-2 家族蛋白的表达等[10-11]。研究表明，大多数抗肿瘤药物可通过内源性线粒体途径发挥细胞毒性作用，即通过破坏线粒体而激活上游的 caspase-9 基因，进一步活化下游的 caspase 家族基因，最终导致细胞凋亡[12]。

本研究中，我们发现虎杖苷与顺铂联用后对卵巢癌细胞的生长增殖具有抑制作用，且随着联合浓度的升高，细胞出现明显凋亡现象。并进一步用 Western blot 检测凋亡相关蛋白 caspase 家族蛋白 caspase-9、PARP 的表达，发现随着联合浓度增强，cleaved caspase-9 和 cleaved PARP 出现明显表达。此外，我们检测了线粒体相关蛋白 Bax 与 Bcl-2 的表达。结果显示，线粒体促凋亡蛋白 Bax 表达增强、抗凋亡蛋白 Bcl-2 降低，由此说明虎杖苷与顺铂联用是通过激活内源性线粒体途径而诱导细胞凋亡的发生。

综上所述，虎杖苷能增强卵巢癌细胞对顺铂的药物敏感性，两者联用能使卵巢癌细胞凋亡增强，而凋亡机制主要是涉及线粒体凋亡途径的发生。这为临床治疗卵巢癌提供了新思路。我们应该着力从传统中药中寻找有效成分，与临床抗癌药物联合治疗，以增强药物敏感性，降低耐药行为的发生。

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Effect of polydatin in combination with cisplatin on the apoptosis in human ovarian cancer cell line SKOV3

SUN Ya, ZHAO Yong-mei, QI Guang-zhao, LI Ting-ting, MENG Hai-yang, ZHU Zhen-feng

We aim to observe the effect of polydatin in combination with cisplatin on the proliferation and apoptosis in human ovarian cancer cell line SKOV3 and investigate its mechanism.

The survival rate of SKOV3 cells was detected using MTT method, after treatment with different concentrations of polydatin, cisplatinor both polydatin and cisplatin. The apoptosis rate and morphological changes of late apoptosis were measured by Annexin V-FITC staining and the Hoechst33258 staining method, respectively. The expression of Bax, Bcl-2, cleaved caspase-9, and cleave PARP was measured by Western blot.

MTT results showed that SKOV3 cells significantly decreased cell viability after combined administration of polydatin and cisplatin in a time- and concentration-dependent manner; monoclonal results showed that the combination of polydatin and cisplatin inhibited cell proliferation. Annexin V-FITC single staining showed that the apoptosis rate of the combined administration group was increased by 11.5% compared with the cisplatin administration group. The Western blot test showed that the combined administration group was compared with the single drug administration group. The expression of cleaved PARP and cleaved caspase-9 was increased. The mitochondrial apoptosis-related protein Bax increased and Bcl-2 decreased.

Polydatin can enhance the anticancer effect of cisplatin on SKOV3 cells by promoting apoptosis.

Cisplatin; Apoptosis; Mitogen-activated protein kinases; Polydatin

ZHU Zhen-feng, Email: zhenfeng1997@sina.com

Author Affiliations: Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Henan 450053, China (SUN Ya, ZHAO Yong-mei, QI Guang-zhao, MENG Hai-yang, ZHU Zhen-feng); Department of Pharmacology, School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 210038, China (LI Ting-ting)

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.005

国家自然科学基金（81503150）；河南省医学科技攻关计划项目（201303026）；北京医卫健康公益基金会医学科学研究基金（YWJKJJHKYJJ-B16239）

450053 河南，郑州大学第一附属医院药学部（孙雅、赵咏梅、齐光照、孟海阳、朱振峰）；210038 南京，中国药科大学药学院药理系（李婷婷）

朱振锋，Email：zhenfeng1997@sina.com

2019-09-03