甘肃地区宫颈鳞癌和腺癌患者人乳头瘤病毒感染基因亚型分布研究
2019-12-23周庆云石清芳王东存唐兆瑞
周庆云，石清芳，赵 洁，王东存，唐兆瑞
（甘肃省妇幼保健院，甘肃 兰州 730050）
宫颈癌是严重威胁女性生命和健康的恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌，死亡率在全球妇女癌症中居第二位，在一些发展中国家甚至居首位。宫颈癌包括宫颈鳞癌和宫颈腺癌，宫颈腺癌较少见，但近年来其发病率明显上升，与同期宫颈鳞癌相比预后更差。目前，已经明确高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染是宫颈癌的病因[1]，HPV16、18型与70%的浸润性宫颈癌相关[2-3]。本研究通过检测甘肃省内宫颈鳞癌及腺癌患者感染人乳头瘤病毒（HPV）的基因亚型状况，探讨不同基因型HPV感染的致癌性，对本地区妇女宫颈癌早期发现和早期诊治具有重要价值，为HPV疫苗开发研制提供科学依据。
1 对象与方法
1.1 对象
2014年11月至2018年5月甘肃省妇幼保健院妇科门诊和住院，未经放疗、化疗，经病理组织学诊断为宫颈鳞癌患者377例，年龄26～79岁，平均年龄49.2岁，20～29岁7例、30～39岁 56例、40～49岁134例、50～59岁 119例、60～69岁 48例、70～79岁13例；宫颈腺癌患者39例，年龄30～65岁，平均年龄47.8岁，30～39岁6例、40～49岁19例、50～59岁9例、60～69岁5例。患者均为已婚妇女，来自甘肃省内。取患者宫颈脱落细胞进行21种HPV亚型检测。
1.2 仪器与试剂
HPV-DNA提取试剂盒，PCR扩增仪，Hybrimax医用核酸分子快速杂交仪，人乳头瘤病毒基因微阵列分型检测试剂盒（均由香港凯普公司提供）。
1.3 标本采集与保存
窥阴器充分暴露宫颈，以棉拭子擦去宫颈口分泌物，用凯普公司配套专用宫颈刷置于宫颈口，顺时针旋转5周，慢慢抽出，以获得足够的移行区上皮细胞样本，放入专用细胞保存液（3 ml）中，沿刷柄折痕处折断，旋紧管盖，做好样本标记，立即送检或放置4℃冰箱中，3天内检验。
1.4 检测方法
HPV分型基因检测步骤：（1）样本DNA提取：取样本500 ul，以14 000 r离心一分钟，弃上清液后，用凯普公司试剂盒提取DNA。（2）PCR扩增：将PCR反应试剂及Taq酶按比例混合后在反应管内加入 24 μl，再加入 DNA 模板 1 μl，混匀后进行PCR扩增。每批同时扩增HPV18型阳性对照及阴性对照各一份。（3）核酸分子快速导流杂交：采用Hybrimax医用核酸分子快速导流杂交仪及配套试剂盒，在杂交平台放入标记有21种HPV基因型寡核苷酸探针的低密度基因芯片杂交膜，按试剂盒说明进行导流杂交，酶标显色。（4）结果判断：肉眼观察检测结果，阳性点为清晰可见的蓝紫色圆点，根据膜条HPV分型分布图，判断为何种HPV病毒类型。本检测将HPV分为21种亚型，包括 15 种高危亚型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68 型，6 种低危亚型：6、11、42、43、44、81 型。有两型或两型以上者为多重感染。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，以百分率作为HPV感染的评价指标，HPV检出率采用χ2检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 宫颈鳞癌和腺癌患者HPV感染型别分布
377例宫颈鳞癌患者HPV总感染率为95.5%（360/377），共检测到 17种 HPV 亚型，其中高危型 13种（16、58、18、33、31、52、39、68、51、53、45、56、59 型），低危型 4 种（81、44、42、43型），未检测到 6、11、35、66 型。HPV16 型感染率最高，为76.7%，其次是58型（6.1%），见表1。39例宫颈腺癌患者HPV总感染率为48.7%（19/39），共检测到6种HPV亚型，均为高危型单一感染，依次为 16型（47.4%），18型（26.3%），52型（10.5%）和58、51、45型（均为 5.3%），见表 2。
2.2 HPV单一感染和多重感染与宫颈鳞癌、腺癌的关系
本研究中，宫颈鳞癌HPV阳性患者共360例，单一感染319例，占88.6%，在多重感染的41例患者（11.4%）中，二重感染39例，占多重感染的95.1%，最常见的是HPV16型合并其他亚型感染，共37例，占90.2%；三重感染2例，其中1例是HPV16型合并其他亚型感染。单一感染率与多重感染率差异有显著性（P<0.05），见表1。19例HPV阳性宫颈腺癌均为高危型单一感染，见表2。
3 讨论
大量流行病学和分子生物学研究表明，HPV与宫颈癌及癌前病变密切相关[4]。现已发现两百多种型别的HPV，根据其致病性分为高危型和低危型两大类[5]，长期持续感染高危型可以致癌，危及患者生命。本研究中，宫颈鳞癌患者仅检出4例感染低危型，且均与高危型HPV16型合并感染，宫颈腺癌患者中未检出低危型，证实了只有感染高危型HPV才会引发宫颈癌的观点。
3.1 宫颈鳞癌和腺癌患者HPV感染的差异
本研究中，宫颈鳞癌、腺癌的HPV总感染率分别为95.5%和48.7%。在一项针对西方国家的Meta分析中，HPV在宫颈鳞癌患者中的感染率为87.3%，在宫颈腺癌患者中的感染率为76.4%[6]。在我国，宫颈鳞癌患者HPV感染率超过80%，而在宫颈腺癌患者中的感染率达50%～70%[7-8]。相比之下，甘肃地区宫颈鳞癌患者的HPV总感染率偏高，而腺癌患者的HPV总感染率偏低，这或许与样本数量较少有关，还需今后进一步研究。
3.2 宫颈鳞癌和腺癌患者主要感染的HPV亚型存在地理差异
最新的亚洲妇女宫颈癌中HPV常见亚型报告显示[9]，无论在西亚还是东亚，HPV16型和HPV18型都是感染率最高的两个型别，而其他HPV感染型别排序有所差异。在西亚地区，HPV45、33、31、35、58、52、56 型和 59 型为继 HPV16、18 型后最常见的 8 种型别，而在东亚地区则为 58、33、52、45、31、59、39、35型。本研究显示，宫颈鳞癌患者感染了17种HPV亚型，如HPV16、58、18、33、31、52、39、68、51、53 型等，主要感染亚型与文献报道基本一致。喻朝霞等[10]报道，南方地区宫颈鳞癌患者HPV 主要感染亚型依次为 16、18、33、58、31、52、59、45 型；陶萍萍等[11]报道北京宫颈癌患者HPV主要感染亚型依次为16、18、52、58、33型。说明我国南、北方地区宫颈癌患者主要感染的HPV亚型存在一致性，但也存在地理差异。本次研究中宫颈鳞癌患者主要感染的为HPV16、58型，与国内研究结果有一定差异，值得重视。文献报道宫颈腺癌主要感染亚型为16、18、39型[7]或 16、18、31、33、52、58 型[12]。本研究中宫颈腺癌 HPV 主要感染16、18、52、58、51、45 型，主要型别相同，16、18 型之后排序有一定差异，这可能与地域、种族和样本量不同有关。
3.3 单一感染较多重感染更有可能增加宫颈鳞癌和腺癌发生率
对于HPV多重感染是否会促使宫颈癌发生，目前研究观点尚不一致。有学者认为多重感染并不增加宫颈癌发生率[4]，但也有学者认为多重感染促使宫颈癌发生，并使治疗更加棘手[13]。本研究中，宫颈鳞癌HPV单一感染和多重感染比为7.8∶1，单一感染率明显高于多重感染率，在宫颈鳞癌HPV感染主要型别方面单一感染与多重感染相比差异有显著性（P<0.05）。国内报道宫颈腺癌均检出多重感染[12]，或以多重感染为主、单一感染为辅[14]。本研究中，宫颈腺癌均为单一感染，与文献有较大差异。在一定程度上说明单一感染对宫颈鳞癌和腺癌的发生发展起到促进作用，但其具体作用机制仍需要进一步研究。
研究资料表明，由于清除率低，HPV16型感染可能更易导致持续性感染[15]。本研究中，宫颈鳞癌、腺癌中HPV16型单一感染占首位，感染率达76.7%和47.4%，表明甘肃地区HPV16型单一感染可能是宫颈鳞癌和腺癌的主要原因。因此，对于HPV感染者不仅要重视其是否已经出现宫颈病变，积极进行临床治疗，还要重视其所感染的具体亚型，特别是对HPV16型感染者应密切随诊，以便及早发现异常、尽早干预，有效降低宫颈癌发生率。
总之，宫颈鳞癌和宫颈腺癌在流行病学、生物学行为、转移复发模式、生存率以及对治疗的反应等方面均有不同，与同期宫颈鳞癌相比，宫颈腺癌预后更差。宫颈腺癌的发生与HPV感染密切相关，研究其致癌机制对临床诊治意义重大。我国地域辽阔，不同地区及民族宫颈鳞癌、腺癌的主要感染亚型不尽相同。明确一个地区HPV致癌的主要型别，根据感染型别预测病变进展，评估预后，对于指导临床医生确定诊治方案，避免过度治疗具有重要意义，同时能为研制适合本地区的HPV疫苗提供流行病学资料。
