岭南特色饮片制佛手的质量标准研究

张秋霞,汪金玉,陈燕霞,陈康,王红阳,黄玉梅,朱银姬,高明

（1.广州中医药大学中药学院，广东广州 510006；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405；3.广州市药材公司中药饮片厂，广东广州 510360）

佛手为芸香科植物佛手Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle的干燥果实。味辛、苦、酸，性温，归肝、脾、胃、肺经，具有疏肝理气、和胃止痛、燥湿化痰的功效，用于肝胃气滞所致的胸胁胀痛、胃脘痞满、食少呕吐、咳嗽痰多等症[1]。岭南地区临床应用佛手时多蒸制后（称“制佛手”）入药，其目的是降低辛燥性[2]。制佛手作为岭南特色饮片曾收录于《广东省中药炮制规范》（1984版）[2]，但未被《广东省中药饮片炮制规范》2011版（第一册）收载，因而无法对其质量做出客观科学评价与监控。至今尚未见系统的相关研究报道。本研究通过采用薄层色谱法及高效液相色谱（HPLC）法对岭南特色饮片蒸制佛手进行定性定量分析，以期为其质量控制与标准制定提供参考依据。现将研究结果报道如下。

1 材料

1.1 仪器 ALLIANCE高效液相色谱仪（美国Waters公司，e2695四元泵，2998 PDA检测器，自动进样器，柱温箱，Empower3色谱工作站）；BP211D电子天平（d=0.01 mg，德国Sartorius公司）；XS225A电子天平（d=0.000 1 g，瑞士Precisa公司）；TC-15恒温电热套（海宁市华星仪器厂）；KO-300D超声波清洗器（东莞市科桥超声波设备有限公司）。

1.2 试药 橙皮苷（中国药品生物制品检定所，批号：110721-200613）；5，7-二甲氧基香豆素（中国药品生物制品检定所，批号：120711-201213）；5-羟甲基糠醛（5-HMF，中国药品生物制品检定所，批号：111626-201308）；佛手对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：120933-201405）；甲醇（色谱纯，德国默克公司）；纯净水（华润怡宝食品饮料有限公司）；其他试剂为国产分析纯。制佛手样品部分由广州中医药大学中药炮制实验室按文献[2]自制，部分购买于广东省内的某些药店和中药饮片厂，部分购买于广州清平药材市场，经广州中医药大学中药学院高明副教授鉴定为芸香科植物佛手Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle的干燥果实的炮制品。具体见表1。

2 薄层色谱鉴别

2.1 对照品溶液的制备 分别取适量的5，7-二甲氧基香豆素和5-羟甲基糠醛对照品，精密称定，加甲醇溶解，分别配制成浓度为1 mg∕mL和0.1 mg∕mL的溶液，即得。

表1 制佛手样品信息Table 1 Information for processed Fructus Citri Sarcodactylis samples

2.2 供试品溶液的制备 取样品及对照中药材粉末1.0 g，加乙醇10 mL，超声20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇0.5 mL使溶解，即得。

2.3 方法与结果 吸取制佛手饮片供试品溶液与对照品溶液各10 μL，分别点于同一块硅胶GF254薄层板上，以环己烷∶乙酸乙酯（1.5∶1）展开系统，采用硫酸法控制展开缸内湿度，令其在湿度为47%的条件下展开，上行展开8 cm；取出，晾干，置紫外光（365 nm）和荧光（254 nm）下检视；取出，喷体积分数10%硫酸乙醇溶液，105℃烘至斑点清晰；取出，日光下检视。硅胶GF254预制版（青岛海洋化工厂分厂）；温度：室温；湿度：47%。结果见图1～3。

3 橙皮苷与5，7-二甲氧基香豆素、5-羟甲基糠醛含量测定

3.1 对照品溶液的制备

3.1.1 橙皮苷对照品溶液 取橙皮苷对照品适量，精密称定，置100 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成每1 mL含橙皮苷40 μg的溶液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

图1 制佛手饮片薄层色谱图（365 nm）Figure 1 Thin-layer chromatogram of processed Fructus Citri Sarcodactylis（365 nm）

图2 制佛手饮片薄层色谱图（254 nm）Figure 2 Thin-layer chromatogram of processed Fructus Citri Sarcodactylis（254 nm）

图3 制佛手饮片薄层色谱图（日光下）Figure 3 Thin-layer chromatogram of processed Fructus Citri Sarcodactylis（in daylight）

3.1.2 5，7-二甲氧基香豆素对照品溶液 取5，7-二甲氧基香豆素对照品适量，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成每1 mL含5，7-二甲氧基香豆素101 μg的溶液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

3.1.3 5-羟甲基糠醛对照品溶液 取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成浓度为1 mg∕mL的母液，再取1 mL母液；置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，稀释配置成每1 mL含5-羟甲基糠醛1 mg的溶液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

3.2 供试品溶液的制备

3.2.1 橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素供试品溶液 按照《中华人民共和国药典》（《中国药典》）2015版[1]，取样品粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷；再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液；过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。供测定橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素用。

3.2.2 5-羟甲基糠醛供试品溶液 取样品粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL；称定质量，超声40 min，称定质量，用甲醇补足减失的质量；摇匀，滤过，取续滤液；过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。供测定5-羟甲基糠醛用。

3.3 色谱条件

3.3.1 橙皮苷 按照《中国药典》2015版[1]。色谱柱：Thermo C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇—水—冰醋酸（33∶63∶2）；流速：1.0 mL∕min；检测波长：284 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。橙皮苷保留时间为12.116 min。色谱图见图4。

3.3.2 5，7-二甲氧基香豆素 参照文献[3]。色谱柱：Thermo C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇—水（65∶35）；流速：1.0 mL∕min；检测波长：326 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。5，7-二甲氧基香豆素保留时间为5.016 min；色谱图见图5。

3.3.3 5-羟甲基糠醛 参照文献[4]。色谱柱：Thermo C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇—0.01 mol∕L磷酸水（10∶90）；流速：1.0 mL∕min；检测波长：285 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。5-羟甲基糠醛保留时间为6.816 min。色谱图见图6。

3.4 线性关系考察

图4 橙皮苷对照品和样品色谱图Figure 4 Chromatogram for hesperidin reference and sample

图5 5，7-二甲氧基香豆素对照品和样品色谱图Figure 5 Chromatogram for 5，7-dimethoxycoumarin reference and sample

图6 5-羟甲基糠醛对照品和样品色谱图Figure 6 Chromatogram for 5-hydroxymethylfurfural reference and sample

3.4.1 橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素 取橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素对照品溶液，进样体积分别 为 2、 4、 6、 8、 10、 12 μL， 按 照 “3.3.1”“3.3.2”项下进样分析，以峰面积（Y）对橙皮苷的含量（X，μg）进行线性回归。橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素的回归方程见表2。结果表明橙皮苷含量在0.08～0.48 μg和5，7-二甲氧基香豆素含量在0.20～1.212 μg范围内线性关系良好。

3.4.2 5-羟甲基糠醛 取5-羟甲基糠醛对照品溶液，进样体积分别为0.5、1、2、5、10、20、30 μL，按照“3.3.3”项下进样分析，以峰面积（Y）对5-羟甲基糠醛量（X，μg）进行线性回归。5-羟甲基糠醛的回归方程见表2。结果表明5-羟甲基糠醛含量在0.005～0.300 μg范围内线性关系良好。

表2 橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素和5-羟甲基糠醛的回归方程Table 2 The regression equation of hesperidin，5，7-dimethoxycoumarin and 5-hydroxymethylfurfural

3.5 方法学考察

3.5.1 精密度试验 取同一批供试品溶液（n=6），按“3.3”项下色谱条件进样分析，重复6次，记录峰面积，计算橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素、5-羟甲基糠醛的含量。计算供试品溶液中橙皮苷的平均含量为0.858 mg∕g，相对标准偏差（sR）为0.41%；5，7-二甲氧基香豆素的平均含量为2.138 mg∕g，sR为 0.69%；5-羟甲基糠醛含量的平均值为0.142 1 mg∕g，sR为0.77%。表明仪器精密度良好。

3.5.2 重复性试验 取同一批供试品溶液（n=6），按“3.3”项下色谱条件进样分析，重复6次，记录峰面积，计算橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素、5-羟甲基糠醛的含量。供试品溶液中橙皮苷的平均含量为 0.842 mg∕g，sR为 1.16%；5，7-二甲氧基香豆素的平均含量为 2.194 mg∕g，sR为3.82%；5-羟甲基糠醛的平均含量为0.142 4 mg∕g，sR为1.67%。表明该方法重复性良好。

3.5.3 稳定性实验 取同一批供试品溶液（n=6），按“3.3”项下色谱条件进样分析，重复6次，记录峰面积，计算橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素、5-羟甲基糠醛的含量。供试品溶液中橙皮苷的平均含量为 0.841 mg∕g，sR为0.98%；5，7-二甲氧基香豆素的含量的平均含量为 2.152 mg∕g，sR为0.59%；5-羟甲基糠醛的平均含量为0.141 9 mg∕g，sR为0.68%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.5.4 加样回收率实验 精密称取已知含量的样品6约0.5 g，共6份，分别精密加入橙皮苷对照溶液（浓度为0.402 mg∕mL）和 5，7-二甲氧基香豆素对照溶液（浓度为0.750 mg∕mL）、5-羟甲基糠醛对照溶液（浓度为 0.060 mg∕mL）各1 mL；按照“3.2”项下方法制备供试品溶液，按“3.3”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算橙皮苷、5，7-二甲氧基香素、5-羟甲基糠醛的含量。橙皮苷的平均加样回收率为98.26%，sR为1.26%；5，7-二甲氧基香豆素平均加样回收率为96.28%，sR为1.90%；5-羟甲基糠醛的平均加样回收率为98.12%，sR为0.63%。

3.6 样品含量测定 供试品溶液按“3.3”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，每批样品平行测定3次，计算橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素和5-羟甲基糠醛（5-HMF）的含量，结果见表3。

表3 样品中橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素和5-羟甲基糠醛（5-HMF）的含量Table 3 Comparison of the contents of hesperidin，5，7-dimethoxycoumarin and 5-hydroxymethylfurfural in the samples （n=3；）

表3 样品中橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素和5-羟甲基糠醛（5-HMF）的含量Table 3 Comparison of the contents of hesperidin，5，7-dimethoxycoumarin and 5-hydroxymethylfurfural in the samples （n=3；）

编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14橙皮苷[w∕（mg·g-1）]0.595±0.03 0.142±0.02 0.233±0.03 0.221±0.00 0.711±0.01 0.210±0.01 0.583±0.00 0.204±0.03 0.273±0.01 0.788±0.02 0.159±0.00 0.332±0.01 0.233±0.01 0.405±0.01 sR∕%0.60 1.01 1.32 1.31 0.66 1.79 0.44 1.28 1.21 0.34 1.92 2.80 0.83 0.40 5，7-二甲氧基香豆素[w∕（mg·g-1）]1.168±0.01 1.628±0.01 1.181±0.02 0.671±0.01 0.642±0.01 0.801±0.02 1.394±0.01 0.731±0.04 1.411±0.01 1.747±0.09 0.711±0.00 0.916±0.01 0.770±0.00 0.766±0.02 sR∕%0.06 0.52 1.15 0.84 1.69 1.04 0.62 0.86 0.41 0.03 0.46 1.14 0.19 0.90 5-HMF[w∕（mg·g-1）]0.538±0.02 0.142±0.02 0.901±0.03 0.303±0.00 0.400±0.01 0.141±0.01 0.104±0.00 0.091±0.03 0.242±0.01 0.078±0.02 0.169±0.05 0.123±0.00 0.028±0.01 0.067±0.01 sR∕%0.49 1.01 3.72 0.37 2.51 1.18 2.13 1.73 1.29 1.28 0.67 0.71 1.29 1.49

4 讨论

本实验考察了薄层层析不同展开系统及不同检视方法，最终确定以效果较佳的环己烷∶乙酸乙酯（1.5∶1）为展开系统。由于5-羟甲基糠醛在365 nm紫外检视不显荧光，图谱未能显示其斑点特征。而采用254 nm紫外检视及体积分数10%硫酸乙醇为显色剂，105℃烘至显色日光检视，能较好地检视图谱各斑点的特征，故选用以上参数为该薄层色谱的检视条件。本实验所得的薄层图谱斑点清晰，信息量较丰富，可作为制佛手的薄层色谱鉴别方法。

由薄层图谱可见，用254 nm紫外和体积分数10%硫酸乙醇显色后检视，制佛手在与5-羟甲基糠醛对照品相同的位置上显示出主斑点的特征，而生品佛手未显示该斑点特征，该特征可以用于生制品的鉴别。有关炮制对其化学成分和药效的影响目前正在研究中。鉴于此，本研究除按照《中国药典》2015版佛手中橙皮苷含量测定外，还增加测定5，7-二甲氧基香豆素和5-羟甲基糠醛的含量，可为制定和完善岭南特色饮片制佛手的质量标准提供参考依据。

本研究中14批制佛手样品中橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素和5-羟甲基糠醛的含量存在较大差异，橙皮苷含量在0.142～0.788 mg·g-1之间，均值为0.364 mg∕g。按国家药典委员会的要求初步拟定，按干燥品计算，含橙皮苷（C28H34O15）不得少于0.10%。5，7-二甲氧基香豆素含量在0.642～1.747 mg∕g之间，均值为 1.038 mg∕g。按国家药典委员会的要求初步拟定，按干燥品计算，含5，7-二甲氧基香豆素（C11H10O4）不得少于0.50%。5-羟甲基糠醛的含量在0.028～0.901 mg∕g之间，均值为0.238 mg∕g。本实验结果显示：收集的14批样品中3种指标成分含量相差较大，这可能与样品来源的不同、炮制工艺的可控程度不高及储存方法等因素有关。

关于5-羟甲基糠醛的安全性研究比较多，但意见并不统一。有学者认为5-羟甲基糠醛是有害的，有致突变、生殖毒性及致癌变的作用[5-7]；另一方面，有学者研究显示5-羟甲基糠醛有抗心肌缺血、抗氧化、抗镰状细胞贫血等生物活性[8，9]。制佛手炮制过程中生成的5-羟甲基糠醛，其作用是有益或是有害仍有待进一步研究验证。