人胃癌细胞系SGC-7901干细胞样细胞的富集与鉴定

林静瑜,黄可儿,秦书敏,来慧丽

（1.福建省中医药研究院，福建福州 350003；2.广州中医药大学第一附属医院 广东广州 510405；3.广东省中医院大学城分院，广东广州 510006；4.广东食品药品职业学院，广东广州 510520）

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，其发病率、死亡率分别位于全球恶性肿瘤的第5位和第3位。我国是胃癌的高发国家，2012年全球胃癌新发病例数及死亡例数约50%在中国，且农村胃癌发病率是城市的2～4倍[1，2]。对于进展期胃癌患者，单一的手术、放化疗、免疫治疗等都很难取得理想的疗效[3]。

20世纪90年代肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）假说的提出，为肿瘤的起源、演进以及化疗耐药等提供了新的理论基础[4，5]，靶向肿瘤干细胞有望成为肿瘤防治的新途径。虽然在白血病和一些实体瘤中已成功分离和鉴定出肿瘤干细胞[6-9]，然而直到2009年Takaishi S等[10]从6株人胃癌细胞系细胞株发现CD44可能是胃癌干细胞潜在的特异性标志物时，对胃癌干细胞的研究才真正兴起。但是，分离纯化方法仍是胃癌干细胞研究的一大技术瓶颈。本研究采用成球条件培养法和流式侧群分选法从人胃癌细胞系SGC-7901细胞中富集∕分离干性肿瘤细胞，并从克隆形成能力、成瘤能力以及化疗耐药性鉴定其干细胞样的生物特性，为进一步研发药物对胃癌干细胞的靶向作用提供基础。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人胃癌细胞株SGC-7901，购自中国科学院上海细胞所。

1.2 动物 SPF级雌性4～6周龄BALB∕c（nu）裸小鼠，体质量14～16 g，广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SYXY（粤）2013-0092。

1.3 主要试剂与仪器 RPMI1640培养基、DMEM∕F12培养基、2.5 g∕L胰酶、磷酸盐缓冲液（PBS）、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、B27、N-2（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；无血清条件培养基（DMEM ∕F12，含bFGF 10 ng∕mL、EGF 20 ng∕mL、B27 1%和N-2 1%，临用时配制，4℃保存2周）；Cell-counting kit 8（CCK8，日本同仁化学所）；5-氟尿嘧啶注射液（5-FU）注射液（0.25 g∕支，上海旭东海普药业有限公司，批号：FA141215）；注射用盐酸多柔比星（ADM，10 mg∕瓶，深圳万乐药业有限公司，批号：1407E1）；注射用顺铂（DDP，10 mg∕支，齐鲁制药有限公司，批号：407025CF）；Hoechst33342、维拉帕米（美国Sigma公司）。细胞培养瓶、培养板、超低吸附10 cm培养皿、超低吸附6孔板、超低吸附96孔板（美国Corning公司）；细胞培养箱（美国Thermo公司）；荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；相差显微镜（德国Leica公司）；多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；FACSAria流式细胞仪（美国BD公司）。

1.4 成球条件培养法培养SGC-7901细胞 SGC-7901细胞常规培养于含体积分数10%FBS的RPMI 1640培养基，37℃、5%饱和湿度的CO2培养箱中。取对数生长期的SGC-7901细胞，胰酶消化，离心；无血清条件培养基重悬，转移至预先加入无血清条件培养基的10 cm超低吸附培养皿中或超低吸附6孔板中，隔日添加适量无血清条件培养基；待7～10 d细胞形成体积较大、结构较紧密的悬浮聚集体（第一代细胞球），吸取细胞球，反复轻吹打使其成为单细胞，转入离心管，800 r∕min，离心5 min，弃上清，无血清条件培养基重悬；按一定比例接种到超低吸附培养皿或超低吸附6孔板中，取第3代SGC-7901细胞球进行后续实验。

1.5 流式细胞仪分选侧群（SP）细胞 取对数生长期的SGC-7901细胞，胰酶消化，收集细胞，常温1 000 r∕min，离心5 min，以含体积分数10%FBS的RPMI 1640培养基重悬，计数，调整细胞浓度至1×106个∕mL。取离心管5只，分别加入10 mL细胞悬液，设置为阴性对照组与4个实验组。阴性对照组加入终浓度为30 μg∕mL的维拉帕米与2.5 μg∕mL的Hoechst33342，实验组分别加入终浓度为 4.0、3.5、3.0、2.5 μg∕mL 的 Hoechst33342，避光条件下于37℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育90 min，每10～15 min取出混匀1次，孵育结束取出，避光，于1 200 r∕min，4℃，离心5 min，并用预冷的PBS洗涤2次；过40 μm的细胞筛网，上流式细胞仪检测。350 nm紫外激发Hoechst33342，450∕20 nm带通下收集测蓝光，675 nm带通下收集测红光，Hoechst33342阴性或弱阳性为SP细胞，Hoechst33342阳性为非SP（non-SP）细胞，同时收集分离出的SP细胞与non-SP细胞。

1.6 克隆形成实验 分别吸取“1.4”项SGC-7901细胞球、正常SGC-7901贴壁细胞，以及“1.5”项收集的SP细胞和non-SP细胞，均以含体积分数10%FBS的RPMI 1640培养基重悬，计数后以200个∕孔加入普通6孔板，每孔添加2 mL含体积分数10%FBS的RPMI 1640培养基，各设3复孔，每3 d换液。2周后，弃培养基，加PBS润洗2次，加2 mL多聚甲醛固定15 min，弃甲醛，加吉姆萨染液适量染色30 min，流水轻冲去染液，空气干燥，拍照，计数大于100个细胞（直径大于0.5 mm）的克隆，实验重复3次。

1.7 裸鼠成瘤实验 将BALB∕c（nu）裸小鼠分2批进行实验。第1批：SGC-7901细胞球组和SGC-7901细胞组；第2批：SP细胞组和non-SP细胞组。每组又按接种细胞数分3个小组，即5×105个∕mL、1 × 105个∕mL、1 × 104个∕mL组，每个小组随机分配5只裸小鼠。取SGC-7901细胞球、SGC-7901细胞，当日流式分选收集的SP细胞和non-SP细胞，分别配制为2.5 × 106个∕mL、5 × 105个∕mL、5×104个∕mL 3个密度的单细胞悬液，按分组于小鼠左腋窝皮下注射0.2 mL各细胞悬液。观察裸小鼠一般状态及局部成瘤生长情况，8周后处死，剥瘤，称质量。

1.8 化疗耐药实验 取SGC-7901细胞球及正常对数生长期的SGC-7901贴壁细胞，消化，分别用无血清条件培养基和体积分数10%FBS的RPMI 1640培养基重悬，制备密度为5×104个∕mL的单细胞悬液，分别接种于超低吸附96孔板及普通96孔板，每孔5 000个、100 μL，置于37℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养，18 h后分别加入同体积PBS及各梯度浓度的5-FU、ADM、DDP进行干预，每个浓度设置6个复孔，以加PBS组作为对照组，相应空白培养基组为空白组。干预48 h后，取出，每孔加入10 mL CCK8，继续培养2.5 h，取出，于酶标仪450 nm处检测吸光度[D（λ）]，计算细胞生长抑制率（p）。实验重复3次，取均值。1.9 统计方法 采用SPSS 15.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SGC-7901细胞球的富集∕分离情况 人胃癌细胞系SGC-7901在含生长因子的无血清条件培养基和超低吸附培养皿（板）中3～5 d即能形成数十个细胞组成的聚集团，7～10 d能形成100个细胞以上结构较紧密的细胞球。经传代，成球能力较上一代增加，表现为球体增大，成球时间更快，结构更紧密。见图1。

2.2 SGC-7901 SP细胞的分选情况 Hoechst33342的浓度为2.5、3.0、3.5、4.0 μg∕mL时SGC-7901细胞中SP细胞的检出率分别为4.74%、2.67%、1.24%、0.47%，维拉帕米对照组检出率为0.19%，见图2。以2.5 μg∕mL作为后续收集SP和non-SP细胞的Hoechst33342浓度。

2.3 克隆形成实验结果 SGC-7901细胞球形成的克隆数明显高于SGC-7901细胞（P＜0.01）；SGC-7901细胞SP与non-SP细胞克隆数差异无显著性（P＞ 0.05），见图3。

图1 SGC-7901细胞及无血清条件培养的SGC-7901细胞球Figure 1 SGC-7901 cells and SGC-7901 cell spheres growing from serum-free cultivation

图2SGC-7901细胞SP检出率Figure 2 The rate of SP selection from SGC-7901 cells

2.4 裸鼠成瘤实验结果 成瘤能力是鉴定肿瘤干细胞干性特性的金标准。接种1×105个细胞，SGC-7901细胞球组2周内成瘤3只，成瘤率为60%，而SGC-7901细胞组8周内均未能成瘤；接种5×105个细胞，SGC-7901细胞球组2周内全部成瘤，SGC-7901细胞组成瘤2只，SGC-7901细胞球成瘤能力高于SGC-7901细胞；接种5×105个细胞，SP细胞组与non-SP细胞组8周内分别成瘤3只、2只，其他2个细胞数量级上均未能成瘤，两者成瘤能力差异不明显。见表1。

图3 克隆形成能力比较（n=3）Figure 3 Colony formation activity

表1 各组裸鼠成瘤情况比较Table 1 Comparison of tumor formation in nude rats [n例数（p成瘤率∕%）]

2.5 化疗耐药实验结果 在相同浓度条件下，5-FU、ADM与DDP对SGC-7901细胞球的增殖抑制率呈低于SGC-7901细胞的趋势，见图4。

3 讨论

肿瘤干细胞是一类存在于肿瘤内部，具有自我更新能力和形成异质性肿瘤的细胞，这种细胞能够进一步“分化”形成其他肿瘤细胞，被认为在肿瘤的起动、扩散、维持、转移复发、化疗耐药中起着重要作用。一般认为，胃癌干细胞起源于正常胃干细胞或产生突变的拥有自我更新能力的祖细胞和分化细胞，然而目前为止，胃癌干细胞的分离纯化仍是一大难题，从现有文献报道看，胃癌干细胞主要采用3类分离方法，包括特异性标志物分选法、条件培养分选法和侧群细胞分选法。特异性标志物分选法是针对已经明确干细胞特异性表面标志物的细胞，通过流式或免疫磁珠分离，优点是分离效率高、细胞活力好、分离纯度高，但胃癌干细胞的表面标志物如CD44、CD133、上皮细胞黏附分子等，亦常见于其他干细胞或祖细胞。侧群细胞分选则是利用肿瘤干细胞具有外排核酸结合染料Hoechst33342的生物学特性，通过流式细胞仪加以分离。国内外一些实验室也陆续报道在胃癌细胞系和原代胃癌细胞中分选到侧群细胞，但对其是否具有干细胞特性存在着争议[11-13]。肿瘤干细胞干性生物学特性的稳定与独特的生长“微环境”密切相关。条件培养分选法是基于在含有干细胞赖以生长的条件培养基中，利用肿瘤干细胞能够悬浮聚集成球并维持其自我更新、多向分化和高致瘤性的特点，进行干细胞的富集∕分离[14-16]。

图4 SGC-7901细胞球、SGC-7901细胞对5-FU、ADM、DDP的耐药性比较（n=3）Figure 4 Comparison of drug resistance of SGC-7901 cell spheres and SGC-7901 cells against 5-fluorouracil，doxorubicin hydrochloride and cisplatin

本研究在侧群分选实验中发现，当Hoechst33342浓度为2.5 μg∕mL时，SGC-7901细胞SP细胞分选率最高，约为5%左右，但SP细胞的克隆形成和裸鼠成瘤能力与non-SP细胞并无明显差异。猜测可能有2个方面的原因：一是Hoechst33342本身具有一定的细胞毒性作用，导致SP细胞部分丧失肿瘤干细胞的特性；二是SGC-7901细胞虽然存在SP细胞，但SP细胞不具备肿瘤干细胞特性。

在成球条件培养分选实验中，为防止细胞的贴壁分化，我们将SGC-7901细胞全程培养于超低吸附培养板（培养皿）及含生长因子的无血清条件培养基中，发现SGC-7901细胞成球生长较在普通培养板好，且能够连续传5代以上，其克隆形成能力、化疗耐药性、致瘤性均明显高于正常贴壁生长的SGC-7901细胞，说明该条件下培养的人胃癌细胞系SGC7-7901细胞球具有肿瘤干细胞样生物学特性，同时也证明了胃癌细胞中存在着干细胞。

另外，本研究中SGC-7901细胞球与正常SGC-7901细胞在裸鼠成瘤实验中，移植的细胞数量级未能进一步拉开差距，提示SGC-7901细胞球中干细胞的纯度还有待进一步提高。今后，我们考虑在优化成球培养条件的基础上，结合干细胞相关表型、上皮—间质化等相关特性对胃癌组织及体外胃癌细胞系进行干细胞的分离鉴定，为靶向胃癌干细胞的防治策略研究提供一定的参考信息。