基于便秘模型小鼠相关差异蛋白表达探讨中医“肺与大肠相表里”理论

季幸姝,李燕舞,周福生,侯丽颖

（1.广州中医药大学脾胃研究所，广东广州 510405；2.广州中医药大学期刊中心，广东广州 510006）

中医“肺与大肠相表里”理论，最早源于《黄帝内经》，是中医脏腑表里学说的重要组成部分，对指导临床有着不可忽视的重要作用。结合现代医学的知识，大都认为中医的“肺和大肠”，基本上与现代医学的肺与肠道相吻合。目前对“肺与大肠相表里”的实验研究，从肺与大肠生理、病理上的联系，可以找到一些散在的、间接的证据。胚胎发育期肺与大肠密切的生理关系显示，肺、气管由肠的前肠发展而来，呼吸道上皮和腺体由原肠内胚层分化而成。肺、气管与肠的结构来源是相同的，这可能成为“肺与大肠相表里”这一理论的结构基础，使该理论从蛋白质角度出发研究其实质成为可能。因此，本研究试图从现代医学蛋白质组学的角度，从中医肠病及肺的角度，寻找肺肠相关指标，即通过观察“便秘”模型小鼠的结肠组织差异表达蛋白，研究与分析“肠病及肺”，从而揭示“肠病及肺”的病理机制，以便更好地理解和完善中医脏腑表里理论，为临床治疗和中医理论客观化提供依据。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 NIH小鼠20只，SPF级，雌雄各半，体质量（20±2）g，颗粒饲料喂养，由广东省医学实验动物中心提供。许可证号：SCXK（粤）2008-0002，粤监证字2008A021。

1.2 药品 复方地芬诺酯片，常州康普药业有限公司生产，批号：0903037。

1.3 仪器与试剂 LEICA-UCT型超薄切片机（德国Leica公司）；JEM-1200EX型透射电镜（日本电子株式会社）。体积分数2.5%戊二醛固定液、0.1 moL∕L磷酸盐缓冲液、体积分数1%锇酸固定液、乙醇、Spurr树脂、醋酸铀、枸橼酸（上海生化）。

1.4 复制便秘小鼠模型 实验随机分成2组：正常组、便秘组。按10mg·kg-1含药标准，将复方地芬诺酯片加入9 g∕L生理盐水，每只小鼠灌胃20 mL·kg-1，每日1次。连续4 d。造模结束后观察两组小鼠排便情况。便秘小鼠首次排黑便时间、6 h内的排黑便粒数及黑便湿质量均较正常小鼠明显减少，表明便秘模型复制成功。

1.5 肺组织蛋白提取 实验所用肺组织，分别取自正常对照组和便秘模型组小鼠。肺组织样品冰冻状态放入研磨器中，以坚硬物敲击研磨棒压碎组织，在液氮中研磨样品成粉末状。用刮勺把组织粉末收集于匀浆器内，300 mg组织约需要1 mL裂解液，冰浴中匀浆。1 000 r∕min离心10 min；收集匀浆液于EP管中，液氮反复冻融3次，每次融开后注意混匀。离心管加入核酸酶（DNA酶、RNA酶），按照每500 mg组织中加入质量浓度10 mg∕mL的核酸酶 12 μL、4 μL（或 50 μg∕mL RNase及 200 μg∕mL DNase，）的比例加入，放入冰浴裂解20 min。 15 000 r∕min，4 ℃离心60 min（或40 000 r∕min，4℃离心30 min），收集上清。2-D蛋白定量试剂盒测定每组小鼠肺组织蛋白质后，分别取每个样本的300 μg进行组内样本混合，然后再对混合好的模型组和正常对照组样本分别定量。每次上样前均予再次定量，以保证上样量的精确性。

1.6 双向凝胶电泳（2-DE） 将蛋白样品进行第一向电泳。等电聚焦电泳（IEF）参数设置为：30 V、12 h（胶条再水化）；500 V、1 h；1 000 V、1 h；8 000 V、30 min；10 000 V、10 h；500 V、12 h；85 000 Vh收胶。IEF结束后，在平衡缓冲液中平衡胶条。将胶条转移至12.5%十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）胶面上行第二向电泳，参数设置为：2 W∕gel、12 W，50 min后改为17 W∕gel、100 W；直至胶内电泳指示剂溴酚蓝跑出凝胶下缘10 min。然后进行银染。

1.7 图像采集与分析 使用ImageScanner专业图像扫描仪对凝胶成像，用PDquest凝胶图像分析软件进行图谱分析。凝胶图像经识别、分析后，寻找差异点。选取蛋白斑点丰度差异大于2.5倍的蛋白质斑点，且同组2块凝胶图谱均出现相同变化，视其为差异蛋白点。

1.8 质谱图的获取 用Spot Handling Workstation对染色的凝胶处理，取AnchorChip靶点样后在质谱上进行基质辅助激光解吸电离—串联飞行时间质谱（MALDI-TOF∕TOF）分析，获得肽质量指纹图谱（PMF）和利用LIFT软件将对4个强度最大峰肽段进行串级质谱分析。

1.9 质谱数据的分析 使用Biotools软件检索，以MASCOT为搜索引擎在NCBInr数据库中进行搜索，参数设置为：检索种属为Rattus；数据检索的方式为combined；最大允许漏切位点为1；酶为胰蛋白酶。质量误差范围设置：PMF 50 ppm，MS∕MS 0.5 Da。

2 结果

2.1 2组小鼠肺组织蛋白质差异表达 正常对照组和便秘模型组银染小鼠肺组织蛋白质2-DE图像如图1、2。选取3个明显差异蛋白质点（蛋白表达量均相差2.5倍以上），其中BD1、BD3为下调蛋白，BU3为上调蛋白。差异蛋白点放大，如图3。

图1 正常小鼠肺组织蛋白2-DE分离图像及差异蛋白分布Figure 1 Two-dimensional electrophoresis（2-DE）separation image of total proteins in lung tissues of normal mice and distribution of the differential proteins

图2 便秘小鼠肺组织蛋白2-DE分离图像及差异蛋白分布Figure 2 2-DE separation image of total proteins in lung tissues of cough mice and distribution of the differential proteins

图3 BD1、BD3、BU3差异蛋白点放大图Figure 3 The amplified plot in various differential protein spots

2.2 搜索数据库鉴定差异蛋白质 将2组小鼠肺组织差异蛋白质的PMF，通过Mascot搜索软件匹配到swissprot数据库中，BD1、BD3、BU3分别鉴定为细胞色素c氧化酶亚基5A（COX5A）、过氧化物氧化还原酶2（Prdx-2）和肌球蛋白调节轻链2（MLC-2）。各蛋白鉴定信息详见表1。

3 讨论

本研究通过数据库检索分析结果发现，便秘小鼠肺组织3个差异表达蛋白质COX5A、Prdx-2、MLC-2都能在现有数据库获得匹配信息，前二者为氧化—抗氧化系统蛋白，后者为细胞骨架蛋白。便秘小鼠肺组织COX5A、Prdx-2表达量均降低，而MLC-2表达量升高。从中可以看出，氧化—抗氧化系统失衡可能是肠病及肺的发病机制之一。

有研究认为，肠道不仅是人体内最大的贮菌所和内毒素库，而且是触发全身炎性介质释放的启动器，肠道内细菌或内毒素的移位，和胃肠道相关淋巴组织及其他肠黏膜细胞产生促炎反应释放大量促炎介质关系密切，它们共同的病理生理学基础，是肠道的缺血再灌注损伤；肠道缺血再灌注损伤后的直接结果，是损害肠黏膜屏障和激发肠道促炎反应[1]。

各种致病因素在肺内造成的损伤都可激活巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞和上皮细胞，引起各种介质释放，如细胞因子、趋化因子、血小板活化因子（PAF）等，同时这些介质也会造成中性粒细胞的活化并释放出活性氧簇（ROS），导致肺内“炎症”过程发生。这一过程固然对杀死各种病原体十分重要，但亦会引起肺内的氧化应激[2]，使细胞发生凋亡或坏死并破坏微血管的屏障功能。

其中肺组织线粒体在氧化应激中起着举足轻重的作用。由于线粒体呼吸链是真核细胞代谢能量三磷酸腺苷（ATP）的主要来源，是有氧呼吸的关键途径，大量消耗的氧直接与线粒体呼吸链的电子传递体系相联系，因此在有氧代谢过程中大量的ROS会持续不断地产生。而线粒体是细胞内ROS的主要发生器，故极易遭ROS攻击而损伤，尤其是在低氧情况下需加强线粒体呼吸链功能时[3，4]。细胞色素c氧化酶（cytochrome oxidase，COX）就是线粒体的标志酶，是线粒体呼吸链氧化磷酸化过程中的关键酶。它直接以氧分子为电子受体进行电子传递，是线粒体完成生物氧化的最后步骤[5，6]。因此，细胞色素氧化酶活性强度的变化直接反映了线粒体有氧代谢的功能状态，其损伤可直接影响线粒体功能，导致ATP合成减少，膜电位丧失，促使呼吸链大量产生ROS，活化凋亡信号通路，细胞出现死亡（凋亡或坏死）。我们研究结果发现的差异蛋白COX5A是COX含亚铁血红素A链。

表1 数据库差异蛋白质鉴定信息Table 1 Information of various differential proteins identified in database

肺内亦存在丰富的抗氧化防御系统，如本研究发现的与Prdx-6同属于非硒依赖过氧化物酶家族的差异蛋白Prdx-2就属于其中，肺内这种抗氧化机制可确保生理状况下氧化—抗氧化系统的平衡，而一旦体内的抗氧化代偿机制被破坏或不足，造成机体氧化—抗氧化系统平衡失调，氧化损伤即开始启动，造成肺损伤[7]。

本研究结果发现，COX5A和Prdx-2在便秘小鼠肺组织中表达水平均较正常组下调，这说明便秘小鼠肺细胞线粒体有氧代谢功能下降，可能是由于过多的ROS在体内不能及时清除，造成肺细胞发生氧化应激损伤的结果。

除此之外，本研究结果还发现，MLC-2在便秘组小鼠肺组织细胞中表达水平较正常小鼠上调。MLC-2是肌球蛋白的重要组成部分，它在调节肌球蛋白的活性中发挥作用，肌球蛋白轻链必须缠绕在重链上才能保持其天然的活性构象[8]。MLC-2是细胞骨架的分子马达，MLC-2通过Ser19、Thr18磷酸化和去磷酸化调节肌球蛋白活性，在有肌动蛋白存在的情况下，控制肌球蛋白头部构象，可大大提高肌球蛋白的ATP酶活性，广泛参与细胞质流动、细胞器运动、细胞迁移、细胞内吞、物质运输、有丝分裂、胞外分泌和信号转导等生物学过程[9]。便秘小鼠肺组织细胞MLC-2表达上调可能是肺细胞为抗氧化应激损伤而产生的防御作用。

从上述研究结果可以看出，便秘小鼠“肠病及肺”时，可能由于大肠传导功能失调不能正常将糟粕排除体外，上逆影响至肺，致肺组织细胞不能正常发挥抗氧化损伤的作用，使ROS在体内大量堆积，造成肺细胞发生氧化应激损伤。

值得一提的是，临床观察常见在创伤、大手术、休克、烧伤等情况下肺往往是第一个受累的器官，这可能是由于肠系膜淋巴管引流的肠淋巴液经胸导管进入右心，肺因而成为暴露于肠源性炎症介质的第一个器官。这种解剖结构可以解释临床上的这一现象[10]，也为本课题进行“肠病及肺”病机研究提供了重要的解剖学原因。

综上所述，“肺与大肠相表里”中的肺与肠在正常情况下可能是处于氧化—抗氧化系统的动态平衡关系。而在各种原因造成的大肠病理状态时，氧化—抗氧化系统平衡被破坏，肺与肠的关系出现紊乱。一旦发生病变，肺肠之病可以相互传变、累及，恶性循环。

其中，作为在“肺病及肠”[11]、“肠病及肺”中均表现差异的过氧化物氧化还原酶（peroxiredoxin）家族蛋白可能起了重要作用，值得进一步探讨。