水体亚硝酸氮的试剂盒定量测定方法

黄海洪，朱艳兰，类延菊，陈灵灵，杨品红

(湖南文理学院 生命与环境科学学院, 湖南 常德 415000)

0 引 言

氮元素的累积是水体富营养化的重要原因[1]。尤其是在水产养殖中，由于使用大量的人工配合饲料，而利用率却比较低，大部分(约75%，以饲料蛋白氮计算)都流失到了水体[2]，最终转化为无机氮，极易被藻类吸收利用，引起过度繁殖。亚硝酸氮是该过程的重要中间产物[3]，具有较强的生物毒性[4]，因而是水环境保护和水产养殖等领域一项重要的监测指标[5-6]。

目前，水体亚硝酸氮的测定以及教学实验一般采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法[7-8]，但是试剂配制比较复杂，操作也较为繁琐。针对亚硝酸氮的测定也开发了商品化的检测试剂盒[9-11]，试剂用量少，容易保存，操作安全、简单，且价格低廉，在生产实践中得到了广泛应用，但是一般只用于定性或半定量的分析，定量测定方面受到的关注较少。本文根据亚硝酸氮常用的分光光度法[9]的测定原理，对商品化试剂盒测定亚硝酸氮的方法进行改良，以期为水体亚硝酸氮的快速测定以及教学实验的开展提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.2 亚硝酸氮标准溶液制备

亚硝酸氮标准溶液参照文献[8]中所述方法配制，稍作修改。亚硝酸钠在100～105 ℃下干燥2 h，称重，溶于蒸馏水中，容量瓶定容、稀释，配制不同亚硝酸氮浓度的标准样品溶液。

1.3 样品处理

样品的处理参照试剂盒操作说明(www.apifishcare.com)进行，稍作修改。取1 mL样品溶液，加入显色剂，混匀，制备显色反应液。静置5 min，待颜色形成并稳定，加入2 mL蒸馏水，混匀，备用以测定吸光度。以蒸馏水为空白对照，按上述步骤制备空白显色反应液。

1.4 测定条件优化

(1)吸收波长的确定。在380～700 nm波长范围内，对标准样品溶液和空白对照的显色反应液吸光度进行扫描，以空白显色反应液作为对照，选取使样品显色反应液吸光度大,而空白显色反应液吸光度小的波长，作为测定波长。

(2)显色剂用量的选择。分别用40～360 μL显色剂处理标准样品溶液，制备显色剂用量不同的反应液，测定吸光度，选取使反应液吸光度大且处于稳定状态的体积，作为显色剂的用量。

1.5 吸光度测定以及回归方程拟合

不同浓度的亚硝酸氮标准样品溶液各取1 mL，按照试剂盒处理方法制备显色反应液，在优化的显色剂用量、吸收波长等参数条件下，测定吸光度。然后以吸光度为横坐标、亚硝酸氮浓度为纵坐标，应用CurveExpert 2.0软件(www.curveexpert.net)绘制标准曲线，拟合回归方程。

1.6 回收率和相对标准偏差计算

标准样品溶液用试剂盒处理，测定吸光度，根据回归方程计算样品亚硝酸氮浓度的理论值，与真实浓度进行比较，按下式计算样品的回收率[7]：

(1)

式中：R为回收率；ρt为标准样品溶液真实亚硝酸氮浓度;ρd为根据回归方程理论计算的亚硝酸氮浓度，mg/L。

测量值相对真实值的标准偏差(相对标准偏差)参照文献[7]所述方法计算，但是本研究的测量值是未设置重复的数据，因此根据文献[12]稍作修改,计算公式如下：

(2)

式中:n为标准样品溶液的数量，n≥2；i= 1，2，…，n；ρti和ρdi分别表示第i个标准样品溶液亚硝酸氮的真实浓度和测量浓度，mg/L。

1.7 含氮物质对亚硝酸氮测定的影响

参照亚硝酸氮标准样品溶液的配制方法，分别制备硝酸钠、氯化铵和大豆蛋白胨标准溶液，然后用亚硝酸氮检测试剂盒进行处理，制备显色反应液，测定吸光度，根据回归方程计算亚硝酸氮浓度，作为由其他含氮物质对亚硝酸氮测定造成的误差浓度，以此研究硝酸氮、氨氮和有机氮等对亚硝酸氮测定的影响。

1.8 统计分析

应用卡方检验方法检查测量值与真实值的差异显著性[12]，通过调用Excel CHISQ.TEST程序实现，P< 0.05为差异显著。

2 结果与讨论

2.1 测定条件

分别测定了1.08 mg/L亚硝酸氮标准样品溶液和空白对照显色反应液在380～700 nm波长范围内的吸光度(图1(a))。结果显示，亚硝酸氮样品的显色反应液在620 nm 处具有最大吸收峰，在540 nm处也有一个较小的吸收峰。但是空白显色反应液在620 nm处也具有单一最大吸光度，且在380～440 nm和600～700 nm范围内，与样品溶液显色反应液的吸光度相差不大。从460 nm开始，样品溶液与空白对照显色反应液的吸光度差别逐渐增大，在540 nm处达到最大，说明此时显色剂对样品溶液的干扰最小。

图1 波长(a)与显色剂用量(b)对样品反应液吸光度的影响

不同显色剂用量条件下0.76和2.15 mg/L两种亚硝酸氮样品的吸光度变化见图1 (b)。结果显示，两种样品溶液均在显色剂用量为200 μL的条件下，达到较高的吸光度，并趋于稳定。

检测试剂盒与分光光度计都是依据比色的原理进行工作，为两种方法的结合应用奠定了基础。但是试剂盒依据肉眼判断进行比色，不够精确。因此，使用试剂盒进行定量测定，需要辅以分光光度计进行精确的吸光度测定。首先要确定最佳的吸收波长，使显色反应液的吸光度最大，提高检测灵敏度，同时使显色剂的干扰最小，检测准确度最优,其次要确定显色剂的用量，使样品充分显色，但是也要控制用量以减小显色剂的干扰[13-15]。根据上述原则，确定540 nm为测定亚硝酸氮浓度的最佳吸收波长，这与重氮-偶氮光度法的吸收波长(543 nm)大致相同[8]。从样品充分显色和减小干扰的角度综合考虑，采用200 μL作为最适的显色剂用量，远远低于其他常用方法的用量[7, 8]。

2.2 标准曲线与回归方程

按照试剂盒处理样品的方法，在显色剂用量为200 μL，波长为540 nm条件下，分别测定了8.60、4.30、2.15、1.08、0.54、0.27、0.13和0.07 mg/L标准样品溶液显色反应液的吸光度，然后以吸光度为自变量、亚硝酸氮浓度为因变量，绘制了标准曲线(见图2)，拟合的回归方程为：

ρ=0.033 7+4.283 5a

r=0.999 8,P<0.01

(3)

式中:ρ为亚硝酸氮浓度;a为吸光度;r相关系数。回归方程极显著(P<0.01)，浓度与吸光度的相关系数0.999 8，表明亚硝酸氮浓度与吸光度具有非常好的线性关系，应用检测试剂盒定量测定硝酸氮含量的方法是可行的。但是，回归方程的常数项大于0(0.033 7)，说明该方法具有测量下限。本研究使用的分光光度计能够读出的最小吸光度为0.001，此时根据回归方程计算可得硝酸氮浓度为0.04 mg/L，可作为本方法的测量下限。Lambert-Beer定律表明吸光度不超过1.0时，浓度与吸光度具有较好的线性关系[14]。因此，假定吸光度为1.0，通过回归方程计算得到硝酸氮浓度为4.32 mg/L，可作为本方法的测量上限。

N-(1-萘基)-乙二胺光度法的测量范围为0.003～0.20 mg/L[7]，边超等[11]研制的水体亚硝酸氮的现场快速测定方法测量范围为0.01～0.20 mg/L，而本文所述方法测量范围为0.04～4.32 mg/L，可能是由于采用的测定试剂不一致造成的。根据说明书，该试剂盒能够识别的硝酸氮最大浓度为5.00 mg/L(www.apifishcare.com)，与本法的测量上限(4.32 mg/L)接近。

图2 吸光度与亚硝酸氮浓度标准曲线

2.3 回收率与测定偏差

测定了浓度分别为0.64、0.96、1.90、3.80、7.60和15.20 mg/L样品溶液的吸光度，根据回归方程得到理论浓度，并计算了回收率。由表1可知，浓度为0.64～3.80 mg/L的样品在本研究方法测定下限和上限范围(0.04～4.32 mg/L)之内，亚硝酸氮的回收率为99.00%～105.61%，相对偏差为 ± 4.54%，符合亚硝酸氮监测的实验室质量控制指标范围(亚硝酸氮浓度 > 0.2 mg/L，回收率95%～105%，偏差 ≤± 5%)[7]，卡方检验结果也显示测量值与真实值差异不显著(P= 0.999 5)。当浓度高于测定上限(> 4.32 mg/L)，虽然浓度为7.60 mg/L样品的回收率也达到99.30%，但15.20 mg/L样品的回收率却只有63.01%，卡方检验显示测量值与真实值差异也不显著(P= 0.069 4)，但相对偏差比较大，达到 ± 34.20%(见表1)，远远超过实验室质量控制指标范围[7]。上述结果表明，在测量范围之内(0.04～4.32 mg/L)本法具有较高的准确度和可信度。

表1 亚硝酸氮测定回收率

2.4 其他含氮物质对测定的影响

表2列举了硝酸钠、氯化铵和蛋白胨(有机氮)标准溶液用API®亚硝酸氮检测试剂盒处理后，反应液吸光度的变化。结果显示，浓度为0.92～92.19 mg/L范围的氯化铵引起的亚硝酸氮误差浓度为0.02～0.09 mg/L，平均0.05 mg/L，稍高于亚硝酸氮的测量下限(0.04 mg/L)，卡方检验显示误差浓度与溶液中真实的亚硝酸氮浓度差异不显著(P= 0.973)。与此类似，3.03～303.44 mg/L的硝酸钠引起的亚硝酸氮浓度误差为0.05～0.06 mg/L，平均0.058 mg/L，与真实浓度差异不显著(P= 0.978)。有机氮对亚硝酸氮测定的干扰差异也不显著(P= 0.783)，10～1 000mg/L(以总氮计)引起的误差浓度仅为0.04～0.37mg/L。应用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定亚硝酸氮时，只有氯胺、氯、硫代硫酸盐、聚磷酸钠和高铁离子等物质的干扰较大，而氨氮、硝酸氮和有机氮等的干扰较小[7]。陈静仪等[9]也认为氨氮、硝酸氮等对亚硝酸氮测定的干扰较小，与本研究的结果一致。

表2 含氮物质对亚硝酸氮测定的影响

注：*，以大豆蛋白胨作为有机氮，浓度用总含氮量表示

3 结 语

结合分光光度法建立了应用试剂盒定量测定水体亚硝酸氮的方法，试剂用量少(200 μL)，操作简便，测定结果与真实浓度无显著性差异(P> 0.05)，具有较高的可信度，回收率在99%以上，回归方程相关系数0.999 8，测定范围0.04～4.32 mg/L，硝酸氮、氨氮和有机氮对测定的干扰也均不显著(P> 0.05)，为水体亚硝酸氮的快速定量测定以及教学实验提供了一种新的手段。