利用芽孢杆菌去除水体中亚硝酸氮的研究

刘韶娜 余东游 赵智勇*

（1. 云南省畜牧兽医科学院，云南昆明650224；2. 浙江大学动物科学学院，浙江杭州310058）

《中国环境状况公报》报道，2017年全国地表水污染依然较重。1 940个水质断面中，Ⅰ至Ⅲ类、Ⅳ至Ⅴ类和劣Ⅴ类水质的断面比例分别为67.9%、23.8%和8.3%。在监测营养状态的112 个重要湖泊(水库)中，劣V类的占10.7%。

亚硝酸盐是氨转化为硝酸盐过程中的中间产物，对鱼、虾的毒性较强，是养殖水域中诱发暴发性疾病的重要因素[1-2]。亚硝酸盐主要通过层状氯细胞主动运输穿过鳃，通过体液积累，并竞争性的与血红蛋白反应生成高铁血红蛋白，降低机体运输氧的能力，从而导致水生生物的窒息死亡[3]，还影响血液中血红蛋白、血糖、红细胞总数、白细胞总数等血液化学指标。并且也会提高其对细菌性疾病的易感性[4-6]。国家地下水质标准中规定饮用水中亚硝酸氮浓度不得高于0.02 mg/l。

研究发现日本囊对虾幼虾养殖中亚硝酸氮的安全浓度为42.739 mg/l[7]，当盐度为2.5%时，墨吉明对虾的半数致死量为20.11 mg/l[8]，亚硝酸氮浓度在4 mg/l以下时，罗氏沼虾的生长能达到最优[9]。亚硝酸氮对凡纳滨对虾的安全浓度为0.2 mg/l[10]。杜浩等[11]报道亚硝酸氮对中华鲟稚鱼的24、48、72 h 和96 h 的LC50及95%可信区间分别为7.05（6.22～8.03）、4.07（1.51～7.88）、3.10（2.07～4.34）mg/l 和2.57（2.31～2.85）mg/l。吕敢堂等[12]就亚硝酸氮对三疣梭子蟹幼体饥饿和饱食两种状态下72 h 半致死浓度（LC50）研究发现分别为0.46 mg/l 和0.56 mg/l，养殖中亚硝酸氮应控制在0.23 mg/l。总之，高浓度亚硝酸氮在水产养殖中对生物具有直接或间接致死作用。

生物降氮技术被认为是目前除氮污技术中最经济的方式，而且还安全无二次污染[13-14]。生物处理中以微生物处理为主，目前已经发现的硝化菌中主要有异养硝化菌和自养硝化菌[15-18]，自养硝化细菌因为分离困难、代时长等特点在一定程度上阻碍硝化细菌作为纯微生物制剂在水产养殖领域的推广应用[19]。目前有关耐高温高盐的亚硝酸盐脱氮菌的特性研究，还较少。

本文通过对已分离到的一株去除亚硝酸氮的菌株JY14 脱氮特性进行研究，为其应用于养殖废水的处理提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用菌株芽孢杆菌来自于实验室分离、鉴定，NCBI中登录号为EU581833.1。

硫酸铵、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、碳酸氢钠、碳酸钙、硫酸铵等试剂。

UNIC 7200 型分光光度计、电子天平、恒温振荡器、高压灭菌锅、恒温培养箱。

基础琼脂培养基：NaNO21 g、FeSO40.03 g、K2HPO41 g、MgSO40.03 g、葡萄糖1 g、蒸馏水1 L、加1.5%的琼脂粉。

人工废水：NaNO20.012 g、FeSO40.03 g、K2HPO41 g、MgSO40.03 g、葡萄糖1 g、蒸馏水1 L，分装到200 ml的三角瓶中，每瓶100 ml，121 ℃灭菌30 min。

1.2 实验方法

1.2.1 分析方法

亚硝酸氮测定：N 一(1-萘基)一乙二胺光度法；硝酸盐氮测定：紫外分光光度法；氨氮测定：纳氏试剂法。

1.2.2 不同因素对菌株JY14去除亚硝酸氮的影响

本实验重点探讨碳源、氮源、温度、pH 值及盐度对菌株JY14的亚硝酸盐去除率的影响。在各个单因素影响试验中，碳源为麦芽糖、蔗糖、淀粉、苯甲酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、草酸钠、甘露醇、葡萄糖；氮源为大豆蛋白胨、胰蛋白胨、甲鱼料、牛肉膏、酵母粉、干酪素；NaCl浓度为0～7%；pH值为3～10；温度为5～60 ℃，每一因素优化结果适用于下一实验。于培养24 h 后测定亚硝酸氮的浓度。

1.2.3 不同时间对菌株JY14 去除亚硝酸氮能力的影响

将JY14 接种于LB 肉汤培养基中，在35 ℃、160 r/min 摇床培养12 h活化，在人工废水中按照1%（v/v）的接种量接入培养24 h 的供试菌株菌悬液（设三个重复），在35 ℃，160 r/min恒温振荡器培养32 h，每隔4 h取样，测定亚硝酸氮含量。

1.2.4 菌株JY14对天然污水中无机氮的影响

本实验重点探讨JY14 在降低亚硝酸氮的同时，对氨氮和硝酸氮的影响。取甲鱼池养殖污水灭菌后按照1%（v/v）的接种量接入培养24 h 的供试菌株菌悬液（设三个重复），在35 ℃，160 r/min恒温振荡器培养12 h，每隔4 h测定一次各种无机氮的的浓度，计算各时段氮与起始浓度含量的百分比。

2 结果与分析

2.1 JY14去除亚硝酸氮的代谢特性

2.1.1 碳源对供试菌株去除亚硝酸氮能力的影响（见图1）

图1 碳源对JY14去除亚硝酸氮能力的影响

由图1可以看出，JY14菌株以甘露醇、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、淀粉为唯一碳源，进行亚硝酸氮去除，在24 h内亚硝酸氮去除率达到95%以上，其中以淀粉为碳源的去除率最高，为96.70%，人工废水中亚硝酸氮浓度可由初始浓度2.53 mg/l降为0.048 mg/l。

2.1.2 氮源对供试菌株去除亚硝酸氮能力的影响（见图2）

由图2 可以看出，当氮源为有机氮源时，JY14 对亚硝酸氮去除率较高，其中干酪素为其去除亚硝酸氮的最适氮源。

图2 氮源对JY14去除亚硝酸氮能力的影响

2.1.3 NaCl 含量对供试菌株去除亚硝酸氮能力的影响（见图3）

图3 NaCl对JY14去除亚硝酸氮能力的影响

由图3 可知，当NaCl 含量为0%时，JY14 对亚硝酸氮去除率达到最高，为98.12%，JY14对亚硝酸氮去除率随着NaCl 含量的增加而降低。可见，氯化钠的存在对JY14去除亚硝酸氮具有抑制作用。

2.1.4 pH 值对供试菌株去除亚硝酸氮能力的影响（见图4）

由图4可知，随着初始pH值的不断升高，JY14的对亚硝酸氮的去除率也不断提高，当pH 值为6.0～7.0时，JY14 亚硝酸氮去除率也达到最大。pH 值为6.0～9.0时，JY14菌株对亚硝酸氮去除率在90%之上。pH值继续升高，亚硝酸氮去除率逐渐下降。由此可见JY14去除亚硝酸氮最适pH值为7.0。

2.1.5 温度对供试菌株去除亚硝酸氮能力的影响（见图5）

图4 pH值对JY14去除亚硝酸氮能力的影响

图5 温度对JY14去除亚硝酸氮能力的影响

从图5中可看出25～40 ℃时，温度对JY14亚硝酸氮去除率影响不显著，当温度在30～40 ℃时，JY14 的去除率均在95%以上，30 ℃为其去除亚硝酸氮的最适温度。

2.1.6 不同时间对供试菌株去除亚硝酸氮能力的影响（见图6）

由图6 可知，16 h 至实验结束时，亚硝酸氮去除率为99.50%。且在8～32 h内亚硝酸氮含量不出现反弹现象。亚硝酸氮的去除主要发生在4～8 h 内，此时JY14生长进入对数期。

2.2 菌株JY14对天然污水中无机氮的影响（见图7）

由图7可知，在0～12 h内，亚硝酸氮、氨氮和总无机氮的含量总趋势呈下降趋势，而硝酸氮含量呈上升趋势，推测原因可能为JY14 在利用亚硝酸盐和铵盐的同时能产生一定浓度的硝酸铵，而总无机盐浓度下降，则说明有部分无机氮被转化为另一种形式的氮，可能为菌体蛋白，也可能为氮气。

3 讨论

环境中自养和异养硝化菌在水体氮的循环中起了非常重要的作用[16-17，20-21]，有机碳源不仅影响异养硝化菌的生长，还影响其硝化特性[20-23]。聂欢欢等[16]分离的具有亚硝酸氮去除能力的地衣芽孢杆菌FP6最适碳源为蔗糖，孙巍等[24]分离的异养硝化菌假单胞菌LT-11 最适碳源为琥珀酸钠。宋君等[23]发现复合有机碳源更能提高短小芽孢杆菌对水体中无机氮的去除。菌株不同则碳源不同，添加有机碳源对于异养硝化菌的无机氮去除具有促进作用[20-24]。本研究则发现添加淀粉和干酪素等有机物可以提高芽孢杆菌JY14 对亚硝酸氮去除率，这与其他学者研究趋势一致[16，22-23]。

刘慧玲等[8]以墨吉明对虾为试验动物，经研究发现硝酸氮浓度为2.5%时其安全浓度最高，韩枫等[25]发现亚硝酸氮对花鲈幼鱼的危害性与盐度呈反比，说明一定盐度能降低亚硝酸氮对水生生物的危害性。JY14 能够适应较宽的NaCl 浓度环境[22]，Mirandaa 等[6]认为0.5%～1.0%时，NaCl会成为亚硝酸氮氧化或氨氧化的重要媒介，王越等[26]发现盐度为2.5%时花津滩芽孢杆菌对亚硝酸氮的去除效率最高，宋君等[23]则通过对短小芽孢杆菌研究发现2.0%～4.0%时，亚硝酸氮的去除效果最佳。而在本实验中JY14去除亚硝酸氮的最佳NaCl 浓度为0%，可能是由于本菌分离于淡水环境，NaCl能够影响菌体生长而间接影响对亚硝酸氮的去除率[22]。

研究发现pH 值在6.5～9.0 之间亚硝酸氮去除率较高[23-29]，李思倩等[27]研究发现在pH 值7.0～9.0之间亚硝酸盐氮去除率较高。刘玉等[28]发现在pH值4.5 时罗伊氏乳杆菌对亚硝酸氮的去除效率最高。宋君等[23]则发现pH 值7～8 之间短小芽孢杆菌BP-171 对无机氮的去除率最高。结合本实验结果认为中性偏酸性的环境最适合菌株JY14 的去除亚硝酸氮。

JY14 适于生长在中等偏高的温度环境中，在5～25 ℃偏冷环境中也能生存[22]。而其他学者研究发现芽孢杆菌最适生长温度为25～40 ℃[30-34]，宋君等[23]发现28 ℃时短小芽孢杆菌BP-171 去除无机氮效率最高。周鲜娇等[35]通过研究芽孢杆菌发现30 ℃时，对亚硝酸氮去除效率最高，唐家毅等[36]则认为芽孢杆菌去除亚硝酸氮的最佳温度为25～35 ℃。这与本实验结果趋势一致，JY14在25～40 ℃时具有较高的亚硝酸氮去除率。在25～40 ℃范围内，温度对其去除亚硝酸氮率影响较小，推测原因可能与其酶类有关，还需进一步研究。

4 结论

本研究结果表明，芽孢杆菌JY14 具有去除亚硝酸氮的能力。该菌在pH 值3.0～10.0 时均具有去除亚硝酸氮的功能，但受影响较大，其去除亚硝酸氮最适pH 值是7.0。能在一定的盐度（0～3%）条件下去除亚硝酸氮，温度对其去除亚硝酸氮能力影响较小，25～40 ℃时均能去除亚硝酸氮，且受影响较小。JY14 去除亚硝酸氮的环境条件较为宽泛，因此本实验分离的芽孢杆菌可作为今后养殖水质调控菌进行深入研究。