大西洋鲑源尾孢虫的形态观察与分子鉴定

王荻，孙伟，陆绍霞，李绍戊，曹永生，卢彤岩，刘红柏

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.哈尔滨工业大学医院检验科，黑龙江 哈尔滨 150006）

21 世纪以来，我国鱼类养殖技术快速发展，已逐渐步入工业化、集约化、规模化的现代化养殖新时期[1]。但水环境恶化、养殖鱼类病害频发等一系列问题严重制约了我国水产养殖业的快速健康发展。鱼类寄生虫病是目前水产养殖中发病率最高的疾病[1]，且寄生虫的损伤还是细菌性体表病发生和流行的主要原因[2]。20 世纪50 年代初，中国科学院水生生物研究所成立鱼类寄生虫研究组，率先对青鱼、草鱼、鲢、鳙四大家鱼的寄生虫进行了研究。随后，我国研究人员在鱼类寄生虫鉴定、流行规律、病理、防治等方面开展了大量的研究工作[1]。

鱼类寄生虫种类繁多，其中粘孢子虫Myxosporidia 是一类在世界范围内广泛分布的[3,4]后生动物寄生虫[5]，主要寄生于鱼体各组织和腔内。迄今已发现的粘孢子虫共有62 属2 180 余种[6]。20 世纪60 年代，我国已有粘孢子虫的研究报道[7]，但直至20 世纪末粘孢子虫分类鉴定仍只能靠肉眼和显微镜观察[8,9]和经验进行传统分类。粘孢子虫体形微小、结构简单、种类繁多、形态相似，单一的形态学鉴定和系统分类极易出现偏差[10]。DNA 序列差异是生物体间最本质的差别[11]，随着分子生物学的飞速发展应用及其技术的不断拓新成熟，分子系统学方法、分子标记、关键种分子数据等逐步应用于具有细微差异的物种间的鉴定[12-14]。20 世纪90 年代初，18S rDNA 首次作为分子标记开始用于粘孢子虫系统分类[15]。18S rDNA 扩增片段为生物中最为保守的基因之一，长度适中、信息充足、容易获得[16]，在粘孢子虫分类学中得到了广泛应用，解决或修正了大量经典分类中存在的争议问题[12]。

目前，我国对冷水鱼寄生虫的研究极少，大西洋鲑源寄生虫的相关研究尚未报道。本文通过对一种大西洋鲑源的寄生虫进行分离观察和鉴定，以丰富冷水鱼寄生虫的研究。

1 材料与方法

1.1 标本来源与虫种观察

观察样本为购自水产品市场的野生样本，经鉴定为大西洋鲑Salmo salar，体长55cm，体质量为2.3kg。标本的处理、观察、测量和辨别方法以及所用术语参照赵元莙等的文献报道[17]。

1.2 样品18S rDNA 片段扩增及序列测定

1.2.1 基因组DNA 的制备

粘孢子虫裂解液的配置：NaCl 0.585g、Tris-base 0.121g、SDS 0.2g、蛋白酶20mg，加入蒸馏水定容至100mL。

用镊子将寄生虫孢囊从寄主肌肉中取出，置于盛有灭菌蒸馏水的平皿中，刺破孢囊将孢子分散于水中，吸取孢子悬液至1.5mL 离心管中，4 000r/min离心10min，蒸馏水重悬，重复离心洗涤一次用以去除杂质。取少量去除杂质的孢子，加入250μL 无菌蒸馏水，向离心管中加350μL 孢子虫裂解液，50℃恒温水浴2h 后，采用常规的苯酚-氯仿抽提方法提取寄生虫孢子基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存备用。

1.2.2 目的片段扩增及序列测定

选用特异性引物[18]，扩增样本DNA 中18S rDNA 目的片段。引物序列分别为ERIB-1：5’-ACCT GGTTGATCCTGCCAG-3’和ERIB-10：5’-CTTC-CG CAGGTTCACCTACGG-3’。25μL 的PCR 反应体系中包括：DNA 模板1μL，上下游引物各0.5μL（10 μmol/L），PremixTaq Version 2.0（含有TaKaRa Taq 1.25 U/μL；dNTP Mixture 各0.4 mM；PCR Buffer 含3 mM Mg2+）12.5μL，加水补足至25μL。PCR 反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延 伸2min，循 环35 次；72℃后 延 伸10min，反应完成后4℃保温。取5μL 扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至吉林库美生物科技有限公司测序。

1.2.3 序列分析与系统发育

将测序所得序列与GenBank 数据库已有序列进行比对并构建系统发育树，用MEGA7.0 软件比对和编辑所得序列,计算遗传距离，并自举检验（重复1 000 次）拓扑结构，获得进化树。

2 结果与分析

2.1 形态观察

在大西洋鲑肌肉样本中肉眼可见大量虫体聚集在一起形成的孢囊。孢囊直径约3～5mm，乳白色，由结缔组织膜包裹（图1-A）；镜检发现，虫体呈倒卵形或纺锤形；壳瓣光滑，无褶皱，壳片向后延长成针状尾突，分开或并拢，缝脊直而明显，孢质中隐约可

图1 大西洋鲑肌肉样本中尾孢虫（Henneguya sp.）的形态结构Fig.1 Morphological structure of Sporozoan Henneguya in muscle samples of Atlantic salmon

见嗜碘泡和圆形胚核（图1-B）。

2.2 18S rDNA 基因片段序列及系统进化分析

本研究得到的大西洋鲑源寄生虫18S rDNA 基因片段序列命名为HLJ，长度为1 338 个核苷酸（nt），其序列信息如图2 所示，并已上传至Gen-Bank,登录号为MK774672。

图2 大西洋鲑肌肉样本中尾孢虫（Henneguya sp.）的18S rDNA 片段序列Fig.2 Sequence of 18S rDNA gene fragment of Sporozoan Henneguya in muscle samples of Atlantic salmon

表1 基于18S rDNA 的遗传距离Tab.1 Genetic distances based on 18S rDNA

所得序列碱基含量为：A=27.88%，T=28.25%，G=26.46%，C=17.41%，表现为AT 含量丰富模式（AT-rich pattern）。以Polypodium hydriforme 为外群，与GenBank 上已有的40 个尾孢子虫属Henneguya 及2 个碘泡虫属Mvxobolus 寄生虫相应序列片段比对，经计算构建的进化树如图3 所示。

结果表明：所得18S rDNA 基因片段序列与登录号为AF378344.1 的楚氏尾孢虫H.zschokkei 和登录号为AF031411 的鲑居尾孢虫H.salminicola 的同源性最高，分别为98.7%和97.4%；这三个序列与尾孢子虫属的另外3个种（H.cutanea、H.zikaweiensis、H.doneci）及碘孢虫属的M.neurotropus 和M.arcticus 聚为一支。

选取进化树中同一分支上的9 个序列进行遗传距离分析，结果表明：H.zschokkei 与所得到的HLJ之间遗传距离最小，为0.0098，而其他不同种间的遗传距离均＞0.01。

3 讨论

引发粘孢子虫病的尾孢虫属寄生虫在我国养殖鱼类中已有所报道，如感染鳜Siniperca chuatsi Basilewsky、鲫Carassius auratus 鳃部的由宿主增生结缔组织形成孢囊的多格里尾孢虫H.doneci[6,19]；寄生于鄱阳湖水域鲫鳃部的徐家汇尾孢虫H.zikawiensis[12]等。目前为止，国内报道多集中于鳜、鲫等鱼类鳃部寄生虫，尚未见冷水鱼感染尾孢虫的报道。

图3 基于18S rDNA 的尾孢子虫及其相关类群的NJ 进化树Fig.3 Phylogenetic tree of Henneguya and relevant taxabased on 18S rDNA sequences data

而本研究发现的寄生虫在大西洋鲑肌肉中形成大量乳白色孢囊，经18S rDNA 序列测定比对发现，与Kent 报道[10]的寄生于加拿大哥伦比亚山地柱白鲑Prosopium williamsoni 体内的楚氏尾孢虫同源性最高，高达98.7%，且遗传距离仅为0.0098。而冉佼等[4]通过基于18S rDNA 序列对粘孢子虫遗传距离的比较研究发现，粘孢子虫种内遗传距离为0～0.042，多集中于0～0.007 之间；而种间遗传距离为0.01～0.323，大部分集中于0.1342～0.1978 之间。本研究比较分析了进化树中分支最近的9 个序列的遗传距离，还发现除同种H.doneci 间遗传距离为0.0022 外，其他种间遗传距离均大于0.01，与冉佼等计算的结果一致。因而，判定本研究所检测的寄生虫为楚氏尾孢虫。

在进化树中，楚氏尾孢虫、鲑居尾孢虫聚成一支后与尾孢子虫属的H.cutanea、H.zikaweiensis、H.doneci 和碘孢虫属的M.neurotropus、M.arcticus 形成一个大的聚类，这样的结果与鲁义善等[20]的研究结果相同，表明碘孢虫和尾孢虫遗传距离较小，可能不是单系进化，仅通过单一的分子生物学方法对两个属进行区分缺乏一定的准确性，应辅以形态学观察等方法进行综合鉴定。尾孢虫与碘孢虫形态学最大差异是具有尾突。而种内和属内种间遗传距离在一定范围内有重叠，表明物种之间的遗传距离可能并不存在绝对的界限[4]。基因序列之间的分歧程度与物种的形成过程密切相关[19]。遗传距离受物种分化历史长短的影响较大，也存在鉴定方法误差问题。因而，要了解掌握我国冷水鱼寄生虫病的发生流行规律，准确鉴定病原仍需进行大量流行病学调查和数据收集整理工作。