姜黄素调控子宫内膜癌细胞糖酵解过程的机制

金纬纬，林一禾，赵小迎，庄晓苹，蔡平生

（温州市中西医结合医院 妇科，浙江 温州 325000）

子宫内膜癌为女性生殖道常见的三大恶性肿瘤之一，其发生率占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%。早期的子宫内膜癌手术效果良好，但特殊或晚期子宫内膜癌预后很差，主要采用以化疗为主的姑息性治疗。化疗的不良反应和多药耐受（multidrug resistance，MDR）是影响化疗疗效的主要原因。根据温伯格效应理论，相较正常细胞，肿瘤细胞更倾向于低氧环境，倾向于利用糖酵解途径获取能量。因此如何阻断肿瘤细胞糖酵解过程，破坏肿瘤细胞赖以生存的低氧环境成为抗肿瘤机制研究的重要突破口。姜黄素是由姜科植物根茎中提取的一种多酚类物质，其植物提取物经纯化的成分早已被用于治疗多种疾病[1]。研究证实姜黄素具有抗氧 化[2]、抗炎[3]、抑制肿瘤作用[1]，可有效诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞的增殖[4]。在前期的研究中，我们发现姜黄素能显著抑制子宫内膜癌细胞的增殖及肿瘤迁移能力，但是其具体作用机制并未完全阐明。本研究旨在研究姜黄素可通过调控子宫内膜癌能量代谢通路，抑制肿瘤细胞生长，及提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株：实验组：子宫内膜癌细胞Ishikawa （子宫内膜腺癌高分化）/HEC-1-B（子宫内膜腺癌中分化）；阴性对照组：正常宫颈上皮ECT1/E6E7细胞；阳性对照组：宫颈癌细胞株Hela细胞株（腺癌）。ECT1/E6E7细胞购自中国医学科学院，Ishikawa、HEC-1-B和Hela细胞由温州医科大学附属第一医院内科实验室赠送。

1.1.2 试剂和耗材：细胞线粒体压力检测试剂盒（103015-100）、细胞糖酵解压力检测试剂盒（货号103020-100）、XF Cell Energy Phenotype Test Kit（103025-100）、细胞能量代谢检测基础培养基（102353-100）、细胞能量代谢检测板（102601-100）购自德国Agilent公司；Cell-tak（354240）购自美国BD公司；乳酸检测试剂盒（MAK064）、丙酮酸检测试剂盒（MAK071）购自德国Sigma-Aldrich公司；TRIzol®Reagent、QuantiTect SYBR Green PCR Kit购自美国Invitrogen公司；cDNA合成试剂盒购自上海生工生物有限公司。5-FU（316-46-1）、姜黄素（458-37-7）购自美国Sigma公司。

1.1.3 实验仪器：细胞培养箱（美国Thermo Scientific公司），Seahorse XFe96细胞能量代谢分析仪（德国Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞能量代谢检测：提前24 h细胞铺板，将细胞接种到Seahorse XF细胞培养板中，在生长培养基中过夜培养；预热仪器，打开Seahorse仪器和电 脑，并打开软件，使仪器升温至37 ℃，过夜预热；水化探针：在Utility Plate中加入Seahorse XF校准 液，将测试板放回Utility Plate上，置于37 ℃无CO2培养箱中过夜水化探针；细胞线粒体压力检测实验中所需试剂浓度：oligomycin为1.5 μmol/L，FCCP为1.5 μmol/L及rotenone/antimycin A为0.5 μmol/L， 体积为25 μL，分别加入A、B、C孔中；细胞糖酵解压力实验所需配置药物浓度：glucose为10 mmol/L，oligomycin为2.5 μmol/L，上述2种药物分别加入 A、B孔中，体积为25 μL，100 mmol/L 2-DG 200 μL加入C孔；上样步骤参照Seahorse X96步骤说明书。

1.2.2 细胞培养：子宫内膜癌Ishikawa细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，子宫内膜癌细胞株HEC-1-B和293T细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。细胞培养条件为5% CO2，37 ℃，恒温恒湿培养箱中培养。姜黄素处理Ishikawa细胞，用于检测能量代谢Seahorse实验，处理浓度为10 μmol/L， 处理时间为24 h。

1.2.3 丙酮酸脱氢酶激酶2（pyruvate dehydrogenase kinase-2，PDK2）敲除子宫内膜癌细胞株构建：shPDK2-pLKO.1-GFP病毒购自上海吉凯基因化学技术有限公司，提前1 d将Ishikawa细胞按每孔3×105接种于6孔板，培养24 h，按1:1 000在培养基中加入shPDK2-pLKO.1-GFP慢病毒，置于37 ℃细胞培养箱中感染过夜；24 h后，更换新鲜培养基（含有10%胎牛血清）；48 h后，准备二次感染，步骤同上；48 h后，流式分选GFP阳性Ishikawa细胞。

1.2.4 RT-qPCR：TRIzol reagent（美国Invitrogen 公司）提取细胞总RNA。反转录PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司，按照说明书步骤进行cDNA扩增。SYBR Green PCR Master MIX（美国Applied Biosystems公司）试剂盒，ABI PRISM 7900 system（美国PerkinElmer公司）进行荧光定量PCR测定。实验中所用的特异性寡核苷酸引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2.5 细胞代谢产物乳酸及丙酮酸检测：取1×106细胞，37 ℃细胞培养箱内培养6 h，培养基体积为500 μL。收取培养上清液，室温2 000 r/min离心 5 min除去细胞，吸取上清液用于检测乳酸含量，根据乳酸测量试剂盒说明操作。收集培养后细胞，室温2 000 r/min离心5 min，弃上清液，留取细胞沉淀，用预冷的1×PBS洗涤1次，留取沉淀用于检测细胞内丙酮酸水平，参照丙酮酸测量试剂盒说明操作。

1.2.6 小鼠皮下成瘤实验：Nude小鼠20只，6～8周龄，由温州医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK（浙）2015-0009；收集子宫内膜癌Ishikawa细胞，皮下注射入裸鼠体内，每只小鼠注射细胞数为1.5×106，皮下注射后2周，观察到小鼠皮下有凸起肿块，进行5-FU（100 mg/kg）及姜黄素（100 mg/kg）处理，腹腔注射，隔天注射，连续1周。5周后，测量小鼠肿瘤体积及质量。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，用GraphPad Prism 7软件作图，数据均来自3个以上独立样本，统计代表至少独立重复3次的结果。计量资料以表示，2组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析与Tukey多重比较检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜癌细胞能量代谢依赖于糖酵解途径 与阴性对照组比，实验组细胞在氧耗率（oxygen consumption rate，OCR）即氧化磷酸化水平差异无统计学意义（P＞0.05），但是在反映细胞糖酵解活性的细胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR）上，实验组细胞显著高于阴性对照组；培养基上清液中乳酸含量检测结果显示，实验组及阳性对照组培养基上清液中乳酸水平显著高于阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；而细胞内丙酮酸含量检测显示，实验组及阳性对照组细胞内丙酮酸含量略高于阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。因此与正常宫颈上皮细胞相比，子宫内膜癌细胞中乳酸分泌量显著增加，胞内丙酮酸含量也略高，提示子宫内膜癌细胞能量代谢更依赖于糖酵解途径。

图1 人子宫内膜癌细胞能量代谢水平检测

2.2 姜黄素抑制子宫内膜癌细胞糖酵解过程 利用姜黄素处理Ishikawa细胞后（10 μmol/L，24 h），与对照组（未经过姜黄素处理）比，ECAR显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），OCR水平2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；子宫内膜癌细胞内及培养基中乳酸和丙酮酸含量经过6 h培养，姜黄素组细胞上清中乳酸含量显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而丙酮酸含量检测显示，姜黄素组细胞内丙酮酸含量略高，差异有统计学意义（P＜0.05），提示姜黄素显著抑制了子宫内膜癌细胞糖酵解途径。见图2。

图2 姜黄素调控子宫内膜癌细胞糖酵解过程

2.3 姜黄素调控PDK2 表达 Ishikawa细胞经过姜黄素处理后，糖酵解代谢相关基因受到显著抑制，其中PDK2作为调控糖酵解途径的重要激酶，其mRNA相对表达水平较对照组低（P＜0.05）；而在Ishikawa细胞中敲除PDK2的表达，敲除组细胞PDK2 mRNA相对表达水平较未敲除组低（P＜0.05）；进一步检测PDK2敲除组细胞能量代谢指标，结果显示PDK2敲除组Ishikawa细胞ECAR显著低于对照组（P＜0.05），而OCR差异无统计学意义（P＞0.05），提示姜黄素通过PDK2调控子宫内膜癌细胞能量代谢通路；胞外乳酸分泌水平检测结果显示，PDK2敲除组乳酸分泌水平较对照组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；细胞内丙酮酸水平检测结果显示，对照组与PDK2敲除组差异无统计学意义（P＞0.05），进一步验证姜黄素通过PDK2调控子宫内膜癌细胞能量代谢通路。见图3。

2.4 姜黄素提升子宫内膜癌细胞化疗敏感性 5-FU 作为临床一线化疗药物，是子宫内膜癌常用化疗方案，但是存在一定的化疗耐受；姜黄素联合5-FU使用，体外细胞培养过程中可显著抑制子宫内膜癌细胞的细胞增殖，见图4A；在动物皮下成瘤模型中，对照组小鼠肿瘤质量为（0.484±0.052）g，姜黄素组为（0.435±0.039）g，5-FU组为（0.206± 0.029）g，联合用药组为（0.321±0.005）g，联合用药组小鼠肿瘤质量最小，与5-FU组比差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组小鼠肿瘤体积为（816.40± 76.17）mm3，姜黄素组为（649.90±86.00）mm3，5-FU组为（335.30±26.31）mm3，联合用药组为（66.18± 11.34）mm3，联合用药组小鼠肿瘤体积最小，与5-FU组比差异有统计学意义（P＜0.05）。综上，姜黄素联合5-FU处理子宫内膜癌细胞，可在体内体外有效抑制肿瘤的增殖与扩增。见图4B。

图3 PDK2调控子宫内膜癌糖酵解过程

3 讨论

图4 姜黄素与5-FU联合用药抑制子宫内膜癌细胞增殖（n=5）

肿瘤干细胞在肿瘤的发生与病程发展、肿瘤的复发、放化疗药物耐受等过程起重要作用，而现有的理论认为肿瘤干细胞存活于独特的肿瘤微环境中，且肿瘤干细胞处于细胞周期静息期，因此相比位于细胞周期内的肿瘤细胞，可能具有相对独特的生理生化反应及能量代谢过程。越来越多的研究显示，代谢途径的改变在肿瘤的发生发展过程中起到重要作用。CHEN等[5]研究显示急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）细胞偏向于利用糖酵解途径进行能量代谢，且其可通过摄取果糖而不是葡萄糖来进行糖酵解过程；CHEN等[6]研究显示在肝细胞肝癌细胞中，癌细胞中调控糖酵解途径的关键转录因子Chrebp显著上调；SUN等[7]研究显示在肺癌细胞中，PDK2表达水平与paclitaxel药物耐受关系密切，而PDK2在调控肿瘤细胞的糖酵解中起重要作用；XINTAROPOULOU等[8]发现在卵巢癌中，与糖酵解途径关系紧密的GLUT1、HK1、PKM2等基因高表达，而下调其表达可显著抑制卵巢癌的增殖过程。因此靶向肿瘤细胞糖酵解过程，阻断肿瘤细胞糖酵解途径已经成为抗肿瘤治疗及抗肿瘤药物研发的重要靶点。本研究结果显示，子宫内膜癌细胞株和正常上皮细胞能量代谢途径存在差异，子宫内膜癌细胞依赖于糖酵解作为主要代谢方式，而姜黄素通过PDK2调控糖酵解代谢通路，抑制子宫内膜癌细胞的增殖与克隆形成，与上述实验结果相符，但是肿瘤细胞是否仅仅利用糖酵解途径作为主要能量代谢途径，尚存在一定的争议。LAGADINOU等[9]研究显示，在人AML细胞中存在两群ROS含量不同的细胞，而肿瘤干细胞主要集中于ROS较低的那群细胞群中，但是这群细胞具有较低的糖酵解及氧化磷酸化水平，但是其利用BCL2抑制剂靶向作用于氧化磷酸化过程，ROS较低的细胞群中，细胞增殖受到显著抑制，而在ROS较高的细胞群中可通过上调糖酵解过程补偿能量代谢，而肿瘤干细胞集中于ROS低细胞群中，因此认为肿瘤干细胞以氧化磷酸化作为主要能量代谢方式，与我们实验结果相悖，但是在本研究过程中，我们亦发现在子宫内膜癌细胞中，氧化磷酸化代谢通路并未减弱，因此在子宫内膜癌细胞中氧化磷酸化通路可能在肿瘤细胞代谢存在一定作用，但是具体其调控方式及途径，有待后续实验进一步探究；而我们现有的实验结果集中于探究子宫内膜癌细胞系，而患者原代组织中分离原代细胞中，癌旁组织细胞、子宫内膜癌细胞及子宫内膜癌干细胞之间能量代谢途径调控差异，我们尚未在原代细胞上验证上述实验结果，有待继续探究。

姜黄素的研究集中于诱导肿瘤细胞凋亡[10-11]、自噬[10]、细胞周期阻滞[12-13]、表观遗传学效应剂[14]等作用，CHEN等[15]发现姜黄素可通过抑制细胞因子相关调控因子SOCS1和SOCS2，抑制JAK2/STAT通路的激活，从而抑制AML和CML细胞的生长和克隆形成能力；TSAI等[16]发现姜黄素可通过抑制NF-κB/MPPs 信号通路抑制非小细胞肺癌的侵袭和迁移过程；但是针对姜黄素调控细胞代谢途径效应剂研究较少。我们前期研究过程集中探究了姜黄素调控子宫内膜癌细胞糖酵解及氧化磷酸化过程，主要集中于糖代谢通路，并未探究其在氨基酸代谢、脂代谢、核酸代谢过程中的作用，而现有的研究显示，氨基酸代谢在肿瘤细胞复发及耐药过程发挥重要作用，如甲氨蝶呤与组氨酸及甘氨酸代谢有密切联系[17]，而脂肪酸代谢[18]、果糖代谢[19]及其调控相关的AMPK通路在AML发生过程中也起到重要作用[18]，因此，姜黄素调控氨基酸及脂肪酸代谢过程靶点及调控方式需进一步实验验证；我们的实验结果中提及姜黄素显著增强子宫内膜癌细胞对化疗药物5-FU的敏感性，而现有的文献报道，肿瘤干细胞的耐药与干细胞独特的代谢方式密切相关，BCL2抑制剂维纳克拉特异性靶向氨基酸代谢，与临床化疗药物阿扎胞苷联合用药，可显著提高AML患者化疗效果，显著延长患者无病生存期[19-20]；研究显示，异柠檬酸脱氢酶IDH1在AML发生与发展过程中起重要作用[21]，而IDH1是三羧酸循环的限速酶，因此IDH1抑制剂可显著抑制AML细胞氧化磷酸化过程，靶向抑制AML细胞氧化磷酸化过程，从而杀伤AML细胞[22]；邢冲云等[23]发现姜黄素通过调控JAK/STAT通路，调控肿瘤细胞的增殖，而现有的文献报道显示JAK/STAT通路同样调控了肿瘤细胞的代谢过程；因此探究姜黄素特异靶向肿瘤细胞代谢途径，及其与临床化疗药物的联合化疗方案，从而降低常规化疗药物使用浓度，降低其对正常细胞毒性作用，调高肿瘤细胞的杀伤效果，亟待后续的研究。