黄鳝白细胞介素1β基因在大肠杆菌中的重组表达及活性分析

2019-12-19臧彧伟郑淑婷

生物学杂志 2019年6期

杨龙，臧彧伟，郑淑婷，李伟

(长江大学生命科学学院，荆州 434025)

白细胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)是细胞因子IL-1家族的重要成员。IL-1β不仅可以促进炎症发生，而且在调节细胞代谢、造血及调控其他细胞因子表达等多种生理过程中起重要作用[1-2]。当受到有丝分裂原、细胞因子和微生物产物等相关因子刺激时，IL-1β分子通过与细胞表面的受体结合激活细胞的免疫调节与炎症反应[3]。机体内IL-1β分子的活性很大程度上受到白细胞介素1受体水平的影响[4]。与哺乳动物等高等脊椎动物不同的是，作为低等脊椎动物，鱼类获得性免疫系统不够发达，更多依赖天然免疫系统中的免疫分子对抗外界病原的侵染[5]。国内外有关于鱼类IL-1β分子在鱼类天然免疫系统中作用的研究由来已久，并取得了非常大的进展[6]。通过基因克隆、组织表达谱分析及重组表达IL-1β分子活性鉴定等研究，鱼类IL-1β分子的功能及表达调控逐渐清晰[7-12]。黄鳝作为我国及东南亚地区广泛养殖的淡水鱼类，其健康养殖受到了多种细菌性病害的制约，开展其天然免疫分子功能的研究对黄鳝养殖业的健康发展具有重要作用。Xu等通过同源克隆的方法得到了黄鳝IL-1β基因序列并阐明了其基因结构；分析了病原类似物对其表达水平的影响，但对其生物学活性及功能并未开展研究[7]。研究指出，醛酮还原酶(AKR)是活性氧产生及炎症反应中的重要指标分子[13]，其表达水平与Nrf2信号通路及NF-κB-IL-1β信号通路间具有密切关系[14]。因此，笔者拟通过基因特异性引物扩增黄鳝IL-1β基因，构建其重组表达载体，实现蛋白的分离及纯化。通过荧光定量PCR技术分析腹腔注射黄鳝rIL-1β重组蛋白对肝脏IL-1β、NF-κB、AKR和Nrf2等基因表达的影响，为深入了解黄鳝IL-1β基因在NF-κB-Nrf2信号通路中的作用提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和菌株

原核表达载体pET28a 购自Novagen公司；大肠杆菌感受态DH5α、BL21(DE3)、pEASY-T1克隆载体等购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶、T4DNA 连接酶等购自NEB公司；质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖胶回收试剂盒、DNA聚合酶等购自北京全式金公司；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)购自Invitrogen 公司；Ni-NTA纯化柱购自上海七海复泰生物科技有限公司；DAB 显色试剂盒、硝酸纤维素膜购自武汉谷歌生物公司；荧光定量用总RNA柱提试剂盒、反转录试剂盒和SYBR Mix均购于南京诺唯赞生物科技有限公司。6His标签的鼠源单抗和HRP标记的羊抗鼠IgG购买于Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 黄鳝IL-1β基因原核表达载体的构建

根据GenBank数据库黄鳝IL-1β基因的序列(KM113036)设计一对基因特异性引物IL-F和IL-R(表1)，以黄鳝肝脏cDNA为模板进行PCR扩增。扩增得到的产物进行纯化后克隆至pEASY-T1载体，转化大肠杆菌DH5α，选取阳性菌落进行序列测定。

测序所得序列在NCBI数据库进行Blastn和Blastp分析，以确定序列同源性。采用在线软件： http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/进行信号肽分析，使用在线软件https://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/PSScan.cgi进行蛋白质二级结构预测。然后根据表达载体pET28a的多克隆位点和测序所得IL-1β基因序列设计一对特异性表达引物rc-F和rc-R(表1)，以pEASY-IL-1β质粒为模板，进行PCR扩增。上、下游引物分别添加了BamHⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后并用胶回收试剂盒回收纯化后与同样双酶切的pET28a进行连接反应。连接产物转化DH5α感受态细胞，重组子经菌液PCR及双酶切验证后进行测序验证。

表1 本研究所使用的引物序列及用途

注：下划线表示酶切位点；F:上游引物，R：下游引物

1.2.2 重组蛋白的诱导表达及纯化

测序验证的质粒转化BL21(DE3)后，于含卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板上过夜培养。挑单菌落接种于5 mL含卡那霉素的液体LB培养基中，于37 ℃ 200 r/min振荡培养过夜。菌液按1∶1000转接于200 mL含卡那霉素(50 μg/mL)的液体LB培养基，37 ℃ 200 r/min振荡培养至OD600值约0.6时，加入终浓度为1 mmol/mL 的IPTG，继续振荡培养4 h。于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min收集菌体，加入5 mL PBS缓冲液，冰浴进行超声波破碎。离心收集上清液，沉淀加入适量PBS 缓冲液(pH 8.0，50 mmol/L，含8 mol/L尿素)重悬，于4 ℃中静置1 h 以上去除包涵体，再次离心，合并收集的上清液。经0.45 μm滤膜过滤后加入镍离子亲和层析柱中结合2 h，用梯度咪唑浓度(20、100、200和300 mmol/L) 的PBS 缓冲液进行洗脱。洗脱液收集装入透析袋中于4 ℃透析过夜，取适量蛋白进行12%的SDS-PAGE电泳检测。

1.2.3 重组蛋白的Western Blot分析

将经IPTG诱导的含空质粒菌株和重组菌的菌液、纯化后的重组蛋白各取100 μL进行SDS-PAGE电泳。随后将蛋白转移到NC膜上，用TBST缓冲液(含5%脱脂牛奶)4 ℃封闭过夜；加入1∶10 000稀释的His标签的一抗后在37 ℃摇床上孵育2 h；加入用Hrp标记的羊抗鼠二抗(1∶15 000)，37 ℃ 孵育1 h；每次反应后用TBST洗5次，每次5 min，最后用DAB(二氨基联苯胺)显色剂显色并拍照。

1.2.4 腹腔注射重组蛋白对肝脏相关基因表达的影响

首先，将纯化得到的rIL-1β蛋白用BCA蛋白质定量试剂盒进行定量。然后，将40尾生长一致的健康黄鳝(体质量50 g±3 g)随机分为两组。一组腹腔注射1 mL 1×PBS作为阴性对照；另一组黄鳝按2.0 μg/kg剂量注射rIL-1β蛋白。分别在首次注射0、3、6、9、12和24 h后从PBS组和IL-1β组中随机取3尾鱼，取其肝脏组织加入500 μL Trizol试剂保存于-80 ℃以备RNA提取，以上生物学实验重复3次。

按照总RNA 提取试剂盒说明书提取黄鳝肝脏总RNA，速冻后置于-80 ℃冰箱中保存备用。按照反转录试剂盒说明书将总RNA 反转录为cDNA，置于-20 ℃中保存备用。

采用荧光定量PCR的方法分析腹腔注射重组蛋白rIL-1β对肝脏IL-1β、NF-κB、AKR和Nrf2等基因表达的影响。设计的荧光定量的引物分别为rt-IL-F和rt-IL-R，rt-NF-F和rt-NF-R，rt-AK-F和rt-AK-R，rt-E2-F和rt-E2-R(表1)。以不添加模板的反应作为空白对照，以β-actin的表达作为内参。荧光定量PCR在CFX96 RT-PCR系统(Bio-RAD)上进行。20 μL反应体系中包含1 μL模板，10 μL SYBR qPCR master mix，0.4 μL上下游引物，8.2 μL ddH2O。PCR反应条件为95 ℃预变性1 min；95 ℃变性5 s，57 ℃退火30 s，共40个循环。

每个处理重复3次，数据处理采用SPSS20.0软件包中的单因素方差分析进行。基因表达值用平均值±标准差表示，并进行多重比较检验。当P<0.05时为差异显著，当P<0.01时差异极显著。

2 结果与分析

2.1 黄鳝IL-1β基因的获得及序列分析

利用基因特异性引物对IL-F/R，从黄鳝肝脏cDNA中扩增得到一条长741 bp的条带，经过克隆测序后分析得知：所得序列推断的多肽链与KM113036序列推断的多肽链间具有95%的同源性；该基因编码的多肽链没有典型的信号肽序列，也没有ICE信号切割位点；但具有IL-1家族的典型信号特征和1个N糖基化位点，属于IL-1β基因家族成员(图1)；该基因在申请GenBank中登录的序列号为KY886912。

阴影表示N-糖基化位点；方框表示IL-1家族信号

图1黄鳝IL-1β基因的核苷酸序列及推断的氨基酸序列

Figure 1 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of swamp eel IL-1β

2.2 原核表达载体的构建、表达纯化及鉴定

利用基因特异性引物对rc-IL-F/R从pEASY-IL-1β质粒上获得含有酶切位点的片段后与pET28a载体分别进行双酶切，回收目的片段连接、转化DH5α感受态细胞。将重组子提取质粒进行菌液PCR和双酶切鉴定。结果表明：阳性重组子扩增得到和目的基因一致大小的片段，并且用BamH I和XhoI对重组质粒进行的双酶切表明，IL-1β基因已经正确插入到pET28a载体中(图2)。测序结果证实，已成功构建黄鳝IL-1β基因表达载体。

1：IL-1β基因的菌液PCR扩增；2：重组质粒的双酶切；M：DNA分子量标准

图2黄鳝IL-1β基因重组质粒的菌液PCR与双酶切检测

Figure 2 PCR and double-enzyme digestion detection of recombinant vector

通过Ni-NTA亲和层析柱用不同咪唑浓度的PBS缓冲溶液进行洗脱，纯化得到了重组蛋白rIL-1β。12%的 SDS-PAGE电泳检测显示纯化的rIL-1β无杂蛋白，分子量约为33 ku，符合预期大小(图3-A)。

将SDS-PAGE凝胶中蛋白转移至硝酸纤维素膜上，分别用小鼠抗6His-tag单克隆抗体为一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠二抗进行Western Blot免疫印迹显示，带有6His标签的融合蛋白被特异性识别，含空质粒的菌株及含重组质粒未诱导的菌株均没有相应条带(图3-B)。SDS-PAGE及Western Blot分析表明已实现了rIL-1β蛋白的诱导表达及纯化。

A：重组蛋白的SDS-PAGE电泳；B：Western Blot检测重组蛋白。1：含空载体的菌株诱导后；2：未诱导的重组菌；3：重组菌IPTG诱导后；4：纯化后的rIL-1β蛋白；M：蛋白质分子量标准

图3重组蛋白rIL-1β的表达与检测

Figure 3 Expression and detection of the recombinant protein rIL-1β

2.3 腹腔注射rIL-1β对肝脏IL-1β和NF-κB基因表达的影响

腹腔注射重组rIL-1β蛋白后，在不同时间点取肝脏组织的总RNA反转录获得cDNA，采用荧光定量PCR分析了IL-1β和NF-κB基因的转录水平。结果表明：腹腔注射rIL-1β蛋白后，各时间点黄鳝肝脏IL-1β基因表达水平都有不同程度增加；除注射后3 h，其余各时间点处理组肝脏IL-1β基因表达水平均显著高于对照组(P<0.05),结果见图4-A。同时期肝脏NF-κB基因的表达水平也呈不同程度的增加；腹腔注射rIL-1β后3 h时，NF-κB基因的表达显著高于对照组(P<0.05)，其余各时间点NF-κB基因的表达水平虽有增加，但未达到显著性差异(图4-B)。这说明外源性的重组rIL-1β蛋白对组织IL-1β和NF-κB基因的表达具有诱导作用。

2.4 腹腔注射rIL-1β对肝脏AKR和Nrf2基因表达的影响

同样地，腹腔注射重组rIL-1β蛋白后，采用荧光定量PCR分析了肝脏AKR和Nrf2基因的转录水平。结果显示：腹腔注射rIL-1β蛋白后，各时间点黄鳝肝脏AKR基因表达水平都有不同程度降低；除注射后3 h，其余各时间点处理组肝脏AKR基因表达水平均显著低于对照组(P<0.05)，同时期肝脏Nrf2基因的表达水平也呈不同程度的减少；腹腔注射rIL-1β后12 h时Nrf2基因的表达显著低于对照组(P<0.05)，其余各时间点NF-κB基因的表达水平呈不同程度的降低，但未达到显著性差异(图5-B)。这说明外源性的重组rIL-1β蛋白对肝脏AKR和Nrf2基因的表达具有抑制作用。

A:荧光定量PCR检测IL-1β的表达; B:荧光定量PCR检测NF-κB的表达

图4腹腔注射重组蛋白rIL-1β对肝脏IL-1β和NF-κB基因表达的影响

Figure 4 Expression analysis ofIL-1βandNF-κBin liver after rIL-1β injection

3 讨论

白细胞介素1β(IL-1β)是机体响应病原感染并激活炎症反应过程中的重要细胞因子[2]。IL-1β分子不但可以启动自身的表达而且还可以协调下游相关基因的表达，进而激活多种下游信号通路[15]。当机体受病原细菌、病毒及其类似物刺激时，IL-1β分子总是快速激活并以不同形式参与抗病毒、抗感染的免疫过程[16]。许多鱼类的白细胞介素1β基因被克隆，其表达模式及在免疫系统中的作用被深入探究。黄鳝是我国及东南亚地区重要的淡水养殖品种，其可持续发展受到了细菌性病害如出血病的制约[17]。开展免疫相关基因克隆及其生物学功能研究有利于促进黄鳝的健康养殖和分子标记辅助育种工作。虽然黄鳝的IL-1β基因已有相关报道，其生物学活性及其在炎症反应中的作用尚不清楚[7]。笔者根据已报道的黄鳝IL-1β基因设计特异性引物，从黄鳝肝脏中扩增获得了黄鳝IL-1β基因的cDNA序列。序列分析发现所克隆的序列与已知序列推断的多肽链之间存在5%的差异，因此作者认为所得序列为已知黄鳝IL-1β基因的一个等位基因。有研究指出，IL-1β基因具有丰富的多态性且与机体的抗、染病能力密切相关[18]。因此，将来有必要深入开展黄鳝IL-1β基因多态性与易感出血病之间关联关系的研究。

A：荧光定量PCR检测AKR基因的表达； B：荧光定量PCR检测Nrf2基因的表达

图5腹腔注射重组蛋白rIL-1β对肝脏AKR和Nrf2基因表达的影响

Figure 5 Expression analysis ofAKRandNrf2 in liver after rIL-1β injection

细菌重组表达的斑点石斑鱼和赤魟鱼的IL-1β蛋白都表现出了良好的生物学活性，通过腹腔注射或者免疫细胞都激活了内源性IL-1β基因的表达[8,19]。本实验中，笔者获得的重组黄鳝rIL-1β也呈现出类似的生物活性，可以激活肝脏IL-1β基因的表达。众所周知，NF-κB是IL-1β的上游转录因子，IL-1β的表达受NF-κB活性的调控作用。笔者发现腹腔注射rIL-1β蛋白一定程度上诱导了肝脏NF-κB基因的表达。IL-1β基因上调的原因可能是rIL-1β蛋白部分激活了NF-κB基因的表达[20]。转录因子Nrf2是活性氧代谢中重要的调控因子，可以调控一系列抗炎、抗氧化等保护性基因的表达维持组织细胞正常生理活动[21]。其中，醛酮还原酶(AKR)就是Nrf2-ARE信号通路的重要靶标之一[22]。本实验中，笔者发现腹腔注射rIL-1β蛋白显著抑制了肝脏AKR基因的表达且一定程度上降低了Nrf2基因的表达水平。因此，AKR下调表达的原因是rIL-1β蛋白对其上游转录因子Nrf2产生了抑制作用[23]。IL-1β基因在Nrf2-NF-κB交叉信号通路中的具体作用有待深入研究。