臭氧水不同作用方式对真菌杀灭效果的比较

张 丹，宁家伟，梁 睿，李 颖，马海利

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

消毒是疫病防治的一项基础性措施，选取有效的消毒剂是保障规模化养殖场生物安全的关键[1]。目前，我国大部分畜禽养殖企业所使用的消毒剂都或多或少存在环保、安全以及消毒不彻底等问题，因此，有必要寻找一种安全无毒的消毒剂进行替代，而臭氧作为一种高效、经济、广谱、绿色的消毒物质，在养殖生产中无疑有着巨大的应用潜力。

臭氧消毒具有广谱性和清洁性，对病毒、细菌繁殖体、细菌芽孢、真菌、霉菌孢子等病原微生物均具有杀灭作用[2-3]，且臭氧的合成原料是空气或者氧气，合成后会快速分解为氧气，消毒后不会残留有害物质。臭氧消毒还具有高效性，同一时间内臭氧对病毒的杀灭效果是氯杀灭效果的几倍[4]，与氯消毒相比，臭氧在很短的接触时间内可取得相同的消毒效果[5]。尽管臭氧在消毒方面的应用被广泛报道，但我国对臭氧消毒技术的应用仍处于起步阶段，需要对臭氧消毒的可能性和限制因素进行深入研究。

本研究以白色念珠菌作为真菌繁殖体代表、以黑曲霉孢子作为霉菌孢子代表，研究臭氧水不同作用方式对真菌的杀灭作用，旨在为臭氧水在畜禽养殖过程中的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验指标菌为白色念珠菌（Candida albicans）ATCC 10231、黑曲霉菌（Aspergillus niger）ATCC 16404 孢子，由山西农业大学动物食品卫生与检验检疫实验室保存。培养基为普通培养基和沙保罗培养基；中和剂为5 g/L 的硫代硫酸钠。

1.2 试验仪器

多功能臭氧发生器（OZU-AP-300，山西中通高技术有限责任公司）、臭氧分析仪（BMT 964，德国BMT 公司）、凯电医用喷雾器（CD500，凯电科技有限公司）

1.3 试验方法

1.3.1 臭氧水的制备 通过OZU-AP-300 型多功能臭氧发生器制备臭氧气体和臭氧水，臭氧水初始pH 值在6.7±0.2，通过冰块调节水温在（10±2）℃。

1.3.2 臭氧水浓度测定 按照文献[6]的碘量法对臭氧水浓度进行测量。

1.3.3 菌悬液、染菌载体的制备 按照文献[7]的方法，以无菌生理盐水制备白色念珠菌和黑曲霉菌孢子悬液，以滤纸片制作菌片。使用麦氏比浊管比对菌液浓度，根据比对结果，稀释菌液进行活菌培养计数，计算菌液浓度。

1.3.4 悬液定量杀菌试验 使用无菌生理盐水，将菌液稀释到1×107～5×107cfu/mL。臭氧水设4 个质量浓度（3，5，10，15 mg/L）进行定量杀菌试验。在检测臭氧水浓度后，吸取5.0 mL 臭氧水加入盛有0.1 mL 菌液的试管中，混匀，分别在作用3，5，10，15 min 后吸取0.5 mL 混合溶液，加于含4.5 mL 中和剂的试管内，混匀静置5 min，终止反应。倍比稀释后，取1 mL 菌液做倾注培养，每管接种2 个培养皿，并置于适宜温度培养，白色念珠菌培养48 h 后计数，黑曲霉孢子培养72 h 后计数，同时设置阳性对照组（4.5 mL 无菌生理盐水代替臭氧水）。根据计数结果，计算杀灭率，重复3 次。

1.3.5 载体浸泡定量杀菌试验 取5 mL 臭氧水加入装有菌片的试管中，分别作用3，5，10，15 min 取出菌片，置于含5 mL 中和剂的试管内，漩涡混合仪振荡20 s，将菌体洗脱。倍比稀释后，培养计数，计算杀灭率，重复3 次。

1.3.6 载体喷雾杀菌试验 根据载体浸泡定量杀菌试验结果，选择10，15 mg/L 的臭氧水，利用医用电动喷雾器（水压60 kPa，脉冲频率1 200 次/min）进行载体喷雾杀菌试验。每种菌所染菌片分开试验。试验时，每种载体菌片各取3 片，以等边三角形排放于无菌玻璃培养皿中。在检测臭氧水浓度后，将臭氧水装入喷雾器水箱。在培养皿斜上方1 m 处进行喷雾，以喷雾量不使菌片流液为度。分别在3，5，10，15 min 后取出菌片，置于含有5 mL 中和剂的试管内，漩涡混合仪振荡20 s，将菌体洗脱。倍比稀释后，培养计数，计算杀灭率，重复3 次。同时设空白对照组，用无菌生理盐水代替臭氧水，按同样方法进行。

2 结果与分析

2.1 悬液定量杀菌结果分析

从表1，2 可以看出，随着臭氧水质量浓度的增加和时间的增加，杀灭率逐步提高。10 mg/L 臭氧水悬液作用5 min 可以完全杀灭溶液中的白色念珠菌（表1），10 mg/L 臭氧水作用3 min 能够完全杀灭悬液中的黑曲霉孢子（表2）。

表1 悬液定量法白色念珠菌杀灭率 %

表2 悬液定量法黑曲霉孢子杀灭率 %

2.2 载体浸泡定量杀菌结果分析

由表3，4 可知，在载体浸泡定量杀菌试验中，要达到100%的杀灭率，需要的时间和浓度都要比悬液定量杀菌试验多。15 mg/L 臭氧水浸泡10 min 能够完全杀灭载体上的白色念珠菌，10 mg/L 臭氧水浸泡10 min 或15 mg/L 臭氧水浸泡5 min 能够100%杀灭载体上的黑曲霉孢子（表4）。

表3 载体浸泡定量法白色念珠菌杀灭率 %

表4 载体浸泡定量法黑曲霉菌孢子杀灭率 %

2.3 载体喷雾杀菌结果分析

用10 mg/L 或15 mg/L 臭氧水喷雾处理白色念珠菌、黑曲霉孢子菌片3，5，10，15 min，白色念珠菌灭活率均在12%以下（表5），黑曲霉孢子灭活率均在21%以下（表6），杀灭率较低，喷雾法灭菌效果不是很好。

表5 喷雾定量法白色念珠菌杀灭率 %

表6 喷雾定量法黑曲霉菌孢子杀灭率 %

3 结论与讨论

本研究采用3 种方法评价臭氧水对真菌的杀灭功效，结果表明，采用悬液定量法和载体浸泡法，10 mg/L 臭氧水作用10 min 能有效杀灭溶液中及载体上的真菌繁殖体和霉菌孢子；比较同浓度臭氧水杀菌效果，杀灭悬液中的真菌时间要短于杀灭载体上的真菌；相同时间内，达到相同效果所需臭氧水浓度悬液法低于载体浸泡法。臭氧水更易杀灭溶液中的真菌[8]，对于载体上附着的真菌则较难完全杀灭，推测可能是载体阻碍了臭氧与真菌的接触，而使臭氧的消毒效果变差[9]。在实践中，可对需要浸泡消毒的器具进行预先处理，除去可见污染物，并通过持续通入臭氧气体的方式，来提高臭氧水消毒效果。

相比较而言，臭氧更适用于水体的消毒[10]。在养殖场中，臭氧可用于污水处理。王华然等[11]研究表明，水温对水中臭氧浓度有非常显著的影响，随着水温的升高，水中臭氧浓度快速降低，且半衰期快速缩短[12]，所以，用臭氧水浸泡消毒时，应对水温进行调控，以提高臭氧溶解度，增强消毒效果。魏兰芬等[13]研究固体过氧乙酸杀菌效果，结果表明，将小牛血清作为有机干扰物，发现在菌液中含10%小牛血清时，臭氧水对大肠杆菌的杀灭率低于10%，有机物会与微生物竞争臭氧而使臭氧消毒效果下降。养殖场采用臭氧处理污水时，最好先对污水进行一定的絮凝过滤措施，并尽可能保持水温在一定范围之内以达到最佳消毒效果[14]。

由臭氧水喷雾杀菌结果可知，以15 mg/L 的臭氧水进行喷雾消毒，作用15 min，对白色念珠菌、黑曲霉孢子的杀灭率均低于40%[15]，没有达到杀菌效果。说明臭氧水喷雾法的杀菌效果较差，不能对载体上附着的真菌进行有效的杀灭[16]。这可能是由于在臭氧水喷施过程中，雾滴体积较小,比表面积变大，水中溶解的臭氧在下落过程中部分臭氧分解为氧气，造成有效浓度的下降，达不到杀菌所需浓度[17-18]。因此，要提高臭氧水喷施的防控效率还需研究其喷洒特性。尽管臭氧水喷雾对环境的消毒效果较差，不适合用于养殖场环境的消毒，但是臭氧水可作为臭氧供体，在全封闭养殖环境中进行臭氧水喷雾，可净化空气、提供氧气[19-20]，有利于畜禽的健康生长。