高效液相色谱法同时测定二维葡醛内酯片中维生素C、维生素B1的含量

李浩然，田芳芳

（1.漯河市药品检测检验中心，河南 漯河 462008；2.漯河市第二人民医院消毒供应中心，河南 漯河462000）

二维葡醛内酯片是由葡萄糖醛酸内酯、维生素C、维生素B1及辅料组成的复方类药物，临床主要用于急慢性肝炎及肝脏中毒的辅助治疗。在其质量标准[1]中维生素C的含量测定采用滴定分析法，维生素B1含量测定采用高效液相色谱法（HPLC），实验操作繁琐费时。我们采用高效液相色谱法同时测定处方中的维生素C、维生素B1的含量，方法简单、快捷，结果准确可靠。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2010c型全自动高效液相色谱仪（LC solution 1.22 sp1色谱工作站，日本岛津）；CPA-225D型电子分析天平（德国赛多利斯）；FE20/EL20型pH计（瑞士梅特勒）。

1.2 试药

维生素C对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100425-201103）；维生素B1对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100390-201505）；二维葡醛内酯片（河北东风药业，批号：17011301，17011302，17051701）；乙腈（色谱纯），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent氨基键和硅胶色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈 0.04 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH至2.5）（66:34）；检测波长：249 nm；流速：1.0 ml/min；进样量：10 μl；柱温：30 ℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合对照品储备液 分别精密称取维生素C对照品100 mg，维生素B1对照品 20 mg，置入50 ml量瓶，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液。

2.2.2 混合对照品溶液 精密吸取混合对照品储备液5 ml，置入100 ml量瓶，加流动相溶解并稀释制成每1 ml中含维生素C 0.1 mg、维生素B10.02 mg的溶液，作为混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液 取二维葡醛内酯片20片，除去糖衣后，精密称定，置研钵中研细，精密称取适量（约相当于维生素C 10 mg、维生素B12 mg），置入100 ml量瓶，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液 按处方比例精密称取辅料0.26 g，再按供试品溶液的稀释方法配制成阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

分别取2.2项下混合对照品溶液、阴性对照溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果辅料对两种成分含量测定无影响，维生素C和维生素B1分离度符合规定，说明色谱条件具有良好的专属性（见图1）。

2.4 线性关系考察

图1 专属性试验HPLC图谱

取2.2.1项下混合对照品储备液，分别加流动相稀释制成每1 ml中含维生素C 0.4，0.2，0.1，0.05，0.025 mg、维生素B10.08，0.04，0.02，0.01，0.005 mg的系列对照品溶液，照2.1项下色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，分别绘制标准曲线，回归方程分别为：维生素C：Y=2.7823×107C1-75 154，r=1.0000；维生素B1：Y=1.8467×107C2-23 408，r=0.9996。

结果表明维生素C在0.4～0.025 mg/ml，维生素B1在0.08～0.005 mg/ml范围内浓度与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

取2.2.2项下混合对照品溶液，连续进样5次维生素C峰面积RSD为0.22 %（n=5），维生素B1峰面积RSD为0.37 %（n=5），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取二维葡醛内酯片（批号：17011301），按2.2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下方法，按外标法以峰面积分别计算维生素C、维生素B1的含量。结果维生素C含量RSD为 0.24 %，维生素B1含量RSD为0.32 %，表明本法重复性良好。

2.7 稳定性试验

按2.2.3项下方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h进样，记录色谱图，维生素C平均峰面积为2 739 987，RSD为0.59 %（n=6），维生素B1平均峰面积为 330 960，RSD为0.63 %，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。

2.8 定量限

取2.2.3项下溶液逐级稀释，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以信噪比为S/N=10:1测得定量限。维生素C定量限为5.4 ng/ml，维生素B1定量限为12.8 ng/ml。

2.9 回收率试验

将对照品按处方量80 %、100 %、120 %和阴对照溶液混合配制模拟样品共9份，照2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样，按外标法分别计算维生素C、维生素B1的回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验（n=9）

2.10 样品测定

取二维葡醛内酯片（批号：17011301，17011302，17051701），分别按2.2.3项下方法制备供试品溶液，每批3份，按2.1项下方法测定，结果见表2。

3 讨论

传统方法维生素C、维生素B1采用C18色谱柱进行含量测定[2-8]，由于维生素C、维生素B1极性较强，其在C18色谱柱上几乎不保留，样品主成分峰、溶剂峰、杂质峰很难实现完全分离。本文采用氨基键合硅胶作为固定相，用乙腈 0.04 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH值至2.5）（66:34）为流动相，能克服维生素C、维生素B1在C18色谱柱上保留不足的问题，有效地分离样品及其中的杂质峰，且该方法前处理简单，有良好的回收率，可快速测定样品中维生素C、维生素B1的含量。用流动相进行含量测定时，增加乙腈的比例，相应地维生素B1的保留时间变长，而维生素C的保留时间缩短，这是由于维生素C和维生素B1酸碱性质不同导致，且流动相偏酸性，可能会使固定相带负电荷的氨基官能团质子化，色谱柱使用一段时间后柱效下降，需要用5～10倍含0.5 %～1.0 % NH3的流动相进行活化。

表2 样品测定结果