三七药材HPLC指纹图谱的优化研究

袁振海，贾婵媛，陈彬合

（山东省药学科学院，山东 济南 250101）

中药材的质量受产地、生长环境、年限和采收时间等因素的影响，2015年版中国药典以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的总量不少于5.0 %作为三七的含量指标，无法从整体上反映三七的内在质量。鉴于此，我们收集了不同产地、不同批次的三七药材，通过高效液相色谱（HPLC）指纹图谱结合主成分分析（PCA）和聚类分析（CA）评价其质量差异性，为客观、全面地建立三七药材的质量标准提供依据，并为中药经典名方的开发提供一定的基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪（Waters e2695泵，Waters 2998PDA检测器，Waters四元在线脱气机，Empower 色谱工作站，美国Waters 公司）；AT261电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；KQ2200D 型数控超声波清洗器（郑州南北仪器设备有限公司）。

1.2 药品与试剂

对照品三七皂苷R1（批号：110745-201619），人参皂苷Rg1（110703-201731），人参皂苷Rb1（110704-201625）均购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯（美国Tedia公司）；水为娃哈哈纯净水。

1.3 药材

三七药材来源见表1。

表1 三七药材来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Welch PG-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为水，B为含0.05 %磷酸水溶液，梯度洗脱（见表2）；流速1.0 ml /min；柱温：30 ℃；检测波长203 nm；进样量10 μl。

表2 梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液的配制

精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rg1对照品及三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每l ml含人参皂苷Rg10.4 mg、人参皂苷Rg10.4 mg、三七皂苷R10.1 mg的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品粉末（过四号筛）0.6 g，精密称定，精密加甲醇50 ml，称定重量，放置过夜，置80 ℃水浴保持微沸2 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 指纹图谱的方法学考察[2]

2.4.1 精密度试验 精密称取编号S13（文山）的三七样品，按2.3项方法制备供试品溶液，依照2.1项色谱条件，连续进样6 次，测得各峰的保留时间RSD＜2.59 %，各峰峰面积的RSD＜3.42 %，表明该法精密度良好。

如图5所示，ST攻击抗ST多抗血清致敏的小鼠足跖后1 h足容积和容积差显著增加，12 h回落，24 h再继续升高，呈现速发相1 h和迟发相24 h两高峰。因此，本研究在后续药物实验中，选择1 h作为速发相时间点，24 h作为迟发相时间点。

2.4.2 重复性试验 精密称取S13（文山）的三七药材粉末6份，按2.3项方法制备供试液，依照2.1项下色谱条件测定，选取分离度较好的11个共有峰进行比较，结果显示，共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均＜3 %，表明该法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取精密度供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，12，24 h进样测定，结果显示，11个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均＜3 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5 各批次三七药材的HPLC分析[3]

分别按2.1项条件测定对照品溶液和15个批次三七药材的供试品溶液，记录色谱图。

图1 三七对照品图谱（P1）及药材的指纹图谱共有模式图（P2）

将文-1～文-5 5批文山三七药材HPLC图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”软件，利用中位数法，以文-3批样品的HPLC 图谱为参照图谱，采用多点校正后进行自动匹配，建立三七药材的HPLC指纹图谱共有模式图，见图1（P2）。混合对照图谱见图1（P1），并根据有关文献[2]推测峰3为人参皂苷Re，峰7为人参皂苷Rd。

采用国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统（2012版），依照相似度计算过程，得到15批三七药材的共有指纹图谱R，结果见图2，指纹图谱共有11个主要共有峰。以此11个共有峰相对峰面积（见表3）作为三七药材质量评价变量指标。

图2 15批三七药材的HPLC指纹图谱

表3 不同产地及批次三七药材指纹峰面积

S7 613 2800 292 123 1653 112 480 46 169 88 329 S8 767 2610 229 148 1469 111 461 126 162 184 639 S9 559 2360 252 104 1356 22 373 287 157 349 483 S10 789 3436 389 152 1863 135 541 289 163 434 741 S11 571 2891 379 115 2101 129 669 132 165 231 568 S12 695 2746 284 125 1642 110 537 324 160 396 129 S13 883 4078 464 176 2630 158 695 163 168 313 729 S14 586 2708 295 115 1686 103 491 201 153 296 609 S15 444 2416 248 89 1803 92 480 309 161 383 349

2.6 指纹图谱相似度评价

以三七药材的共有模式指纹图谱为标准，进行整体相似度评价，15个批次三七样品的相似度均＞0.98，表明上述产地、批次的三七药材整体概貌及主要成分种类差异不大，结果见表4。

表4 不同批次三七药材相似度评价结果

2.7 PCA分析

根据15个批次的三七样品指纹图谱，选取11个共有峰为分析变量，导入SPSS统计软件进行PCA分析，得到主成分的特征值和方差贡献率见表5；特征值图见图3；采用最大方差法旋转因子分析，得到3个因子（即3个主成分）在各原始峰上的载荷，结果见表6。

表5 主成分的特征值和方差贡献率

图3 三七药材特征值图

表6 旋转成分矩阵

以特征值1为提取标准，得到3个主成分的累计方差贡献率达80.9 %，说明其代表三七药材中11个共有峰的大部分信息内容。由表6可见，第一主成分主要反映来自原始色谱峰1～7的信息，第二主成分主要反映来自原始色谱峰8和峰10的信息，第三主成分主要反映来自原始色谱峰9和峰11的信息，故前3个主成分的分析结果基本可显示出不同批次三七药材之间的相似度和差异性。

2.8 SPSS CA分析

以各批次样品中11个共有峰的峰面积为原始数据，对其进行系统CA分析，采用组件连接法，以Pearson相关性为测度，得到聚类树形图，见图4。

图4 15各批次三七药材的聚类树状图

由树状图可见，当聚类距离介于20～25时，可分为2类，云-1、广-1、贵-1、云-4、文-2和文-5聚为一类，其他聚为一类；当聚类距离介于15～20时，聚为3类，云-6、云-7、云-8从中分出，单独聚为一类；当聚类距离介于10～15时，聚为6类；当聚类距离介于5～10时，聚为8类；当聚类距离0～5时，仅云-2和文-3、云-3和文-4、云-7和云-8、云-1和云-4分别聚为一类，其他批均单独为一类，其相似度均大于0.98。

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

考察了4种色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），分别为岛津Inertsustain C18、Welch PG-C18、Welch XB-C18、Agilent Zorbax C18，结果表明在使用Welch PG-C18色谱柱测定三七药材时，基线较稳定，各成分能在较适宜的时间内达到较好的分离。

3.2 流动相的选择

分别考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1 %磷酸水溶液、乙腈-0.05 %磷酸水溶液、乙腈-0.005 %甲酸水溶液进行梯度洗脱，对柱温、流速及进样量进行考察，结果以乙腈-0.05 %磷酸水溶液、流速1.0 ml/min、柱温30 ℃、进样10 μl的色谱条件测定时，三七药材出峰较多、分离最好、峰形最佳、保留时间适宜。

3.3 相似度分析[4]

分析15批次三七药材指纹图谱，结果显示各共有指纹峰面积差异很大，但相似度值均大于0.98。说明药材在成分含量上差异很大，但对指纹图谱反应的药材整体概貌影响不大，即不同产地、批次三七药材中含有的主要成分种类一致，但各成分含量有差异。也从一定程度上证明了药材成分含量受产地、气候等环境因素的影响以及中药材强调道地药材的合理性。

3.4 PCA和CA[5-6]

PCA过程中会自动生成各主成份的权重，在很大程度上消除了人为因素在评价过程中的干扰；CA 能够找到隐藏在众多共性下的差异，对提取的数据进行客观充 分的多元分析，因此两者能较好地保证评价结果的客观性。在将15批三七药材中的11个共有峰为变量进行分析，得到3个主成份的累计方差贡献率达80.9 %，说明3个主成份的分析结果基本可以显示出不同批次三七药材之间的相似度与差异。聚类分析对三七药材进一步进行有效识别，并揭示了不同批次在共有峰含量上的差异，客观反映了三七药材内在质量的真实性与差异性。

3.5 三七药材的来源、质量及其分析结果

我们选购的15批三七药材大多产自云南，贵州、广西各仅1批，未能购到其他产地的三七样品，各样品经检验均符合2015年版中国药典要求，未有伪品、劣品，由此研究了三七药材的指纹图谱且各批相似度值均较高，后续将对其他产地及市售伪品、劣品三七药材进行研究比较。

4 小结

三七药材成分复杂，仅以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的总量作为三七的含量指标，无法从整体上反映三七的内在质量。而中药指纹图谱符合中药整体性和模糊性的特点，因此笔者建立三七指纹图谱对三七药材的整体概况进行质控，同时为避免直观评价的干扰，结合聚类分析和主成份分析对三七药材指纹图谱进行了统计分析评价，可再结合含量测定进一步对主要指标成分含量进行质控，从而为建立较为全面、有效、完善的三七药材评价标准提供参考依据。