响应面法优化通经草总黄酮提取工艺

袁 哲，桑志国，孙 姗，吕元琦*

（1.济南大学 山东省医学科学院 医学与生命科学学院，山东 济南 250200；2.山东省医学科学院 药物研究所，山东 济南 250062；3.国家卫生部生物技术药物重点实验室，山东省罕少见病重点实验室，山东 济南250062；4.德州学院分析测试中心，山东 德州 253023）

通经草又名铜丝草、金丝草等，是中国蕨科粉背蕨属银粉背蕨[Aleuri-topteris argentea(Gmel.)Fée]的干燥全草[1]，具有活血调经、止咳、利湿、解毒消肿等功效[2]，在我国藏族、蒙古族和朝鲜族等少数民族地区应用较普遍。药理研究证实通经草具有抗炎功效，且其药理作用主要与黄酮类组分有关[3]。本研究在单因素试验的基础上，采用响应面法优化通经草总黄酮的超声提取工艺，以期为该药的研究开发提供基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV2800紫外可见分光光度计（上海佑科）；SHK-IIIS循环水式多用真空泵（郑州科泰）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山超声仪器公司）。

1.2 材料与试剂

芦丁对照品（国药集团）；亚硝酸钠（纯度＞99.0 %，天津博迪）；硝酸铝[纯度＞99.0 %，阿拉丁试剂（上海）有限公司]；氢氧化钠（分析纯，西陇化工）；无水乙醇（分析纯，西陇化工）。

2 方法

2.1 通经草总黄酮的提取工艺

将通经草在阳光下晒干，60 ℃鼓风干燥6 h，粉碎，过80目筛。准确称取样品1.000 g，按一定料液比，加入一定浓度的乙醇，超声提取一定时间，滤过，加一定浓度乙醇定容至50 ml，得黄酮粗提物备用。

2.2 测定方法

2.2.1 标准曲线绘制 精密称取5.0 mg芦丁对照品，置入50 ml量瓶，加60 %乙醇溶解，定容，得0.1 mg/ml对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 ml，置入9支比色管，每管加入5 % NaNO2溶液0.4 ml，摇匀，静置6 min；加入0.4 ml 10 %硝酸铝，摇匀，静置6 min；加入4 % NaOH 溶液4 ml，摇匀；加入60 %乙醇定容至10 ml，摇匀，静置15 min[3]，使用紫外分光光度计在510 nm 处测量其吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C，mg/ml）为横坐标，绘制标准曲线。

2.2.2 通经草总黄酮含量测定 取样品溶液5 ml，加入57 %乙醇溶液定容至10 ml，即稀释2倍。取稀释液1 ml，按2.2.1项方法测定样品溶液在510 nm波长处吸光值。依据芦丁标准曲线计算出样品溶液浓度C（mg/ml），再由以下公式计算出通经草黄酮提取量。

通经草总黄酮收率（%）=提取液中通经草总黄酮含量（mg）/通经草药材重量（mg）×100 %

2.3 单因素考察

2.3.1 乙醇浓度对总黄酮收率的影响 准确称取通经草细粉1.0 g，固定料液比为30:1，超声提取75 min，考察乙醇浓度（30 %，40 %，50 %，60 %，70 %）对通经草总黄酮收率的影响。

2.3.2 料液比对总黄酮收率的影响 准确称取通经草细粉1.0 g，加入一定量60 %乙醇超声提取75 min，考察料液比（15:1，20:1，25:1，30:1，35:1）对通经草总黄酮收率的影响。

2.3.3 超声时间对总黄酮收率的影响 准确称取通经草细粉1.0 g，按30:1料液比加入60 %乙醇，考察超声提取时间（30，45，60，75，90 min）对通经草总黄酮收率的影响。

2.4 响应面法优化通经草总黄酮提取工艺

根据Box-Behnken试验设计原理，选用乙醇浓度、料液比、超声时间3个影响因素为自变量，以通经草总黄酮收率为响应值，在单因素试验的基础上，设计3因素3水平三元二次响应面分析方法，进行提取条件的优化，采用Design-Expert进行试验结果分析。响应面试验设计因素与水平见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平

3 结果与分析

3.1 标准曲线绘制

按2.2.1项方法绘制标准曲线，得线性回归方程为y=41.596x+0.0035，R2=0.9998，表明在0.01～0.09 mg/ml范围内，吸光度与浓度的线性关系良好。

3.2 单因素试验

3.2.1 乙醇浓度对通经草总黄酮收率的影响 结果见图1。

图1 乙醇浓度对通经草总黄酮收率的影响

由图1可见，当乙醇浓度在30 %～60 %之间时，通经草总黄酮的提取量随乙醇浓度的增加缓慢增大，当乙醇浓度达60 %时，黄酮提取量迅速达到最高，之后随着乙醇浓度提高，黄酮提取量又迅速下降。这主要是由于提取剂随着乙醇浓度的变化其极性发生变化，只有在适当极性下才能保证提取剂中黄酮的溶解量达最大[4]。因此，乙醇浓度为60 %时利于通经草总黄酮的提取。

3.2.2 料液比对通经草总黄酮收率的影响 结果见图2。

图2 料液比对通经草总黄酮收率的影响

由图2可见，随着液料比的增加，黄酮的提取量先增大后减小，当液料比为30:1时，黄酮提取量最大。推测当液料较小时，随着液料比的增加，通经草粉末与提取液的接触面增加，黄酮类物质向溶剂溶出的阻力减小，使得提取液中溶解的黄酮含量增加[4]。当液料比达30:1后继续增大，可能会因为过多的溶剂对超声波产生一定的吸收，或因溶剂体积过大而影响传质过程，从而导致提取液中的黄酮类物质不增反降[5]。所以30:1的液料比较适宜。

3.2.3 提超声时间对通经草总黄酮收率的影响 结果见图3。

图3 超声时间对通经草总黄酮收率的影响

由图3可见，随超声时间的增加，通经草总黄酮收率呈先增加后减少的趋势，当超声提取时间为75 min时，总黄酮收率达最大值。这是因为黄酮类物质的充分溶出需要足够的时间，但过长时间的超声作用可能使部分黄酮类成分发生降解。因此，选择提取时间75 min比较适宜。

3.3 响应面优化提取工艺结果

提取工艺响应面优化方案及结果见表2。

表2 通经草总黄酮提取工艺响应面优化方案及结果

3.4 回归方程和方差分析

以通经草总黄酮收率为响应值的线性回归方程为：Y=10.27+0.06A+0.34B+0.21C-0.51AB+0.097AC-0.49BC-1.27A2-0.058B2-1.05C2。模型分析结果表明：P＜0.0001，回归模型极显著，失拟项P=0.1018（P＞0.05），失拟项不显著，对试验拟合性较好。R2=0.9961，R2Adj=0.9910，模型拟合程度较好。显著性检验表明，乙醇浓度、料液比、超声时间对通经草总黄酮收率影响显著，影响主次顺序为：料液比（B）＞超声时间（C）＞乙醇浓度（A）。乙醇浓度和料液比交互项AB、料液比和超声时间的交互项BC的P值小于0.001，表明乙醇浓度和料液比，料液比和超声时间的交互作用对通经草总黄酮收率有显著影响。回归方程分析见表3。

表3 响应面回归模型ANOVA分析结果

3.5 等高线和响应图分析

通过Design-Expert 8.0软件对乙醇浓度（X1）、料液比（X2）、超声时间（X3）各因子间的相互作用进行分析，得到了图4～图6的响应面和等高线图。响应面分析图中，响应面越陡峭，则该因素对响应值的影响越显著；相反则该因素影响不显著。等高线图中，可直接观察到各影响因子交互作用强度，等高线接近于圆形，影响因子交互作用不强；相反，等高线越接近于椭圆形，说明两个影响因子间的交互作用较强[5]。由图4、图6可见乙醇浓度（X1）与料液比（X2）、料液比（X2）与超声时间（X3）的等高线接近于椭圆，说明乙醇浓度（X1）与料液比（X2）、料液比（X2）与超声时间（X3）有较强的交互作用。由图5可见乙醇浓度（X1）与超声时间（X3）等高线接近于圆形，说明乙醇浓度（X1）与超声时间（X3）交互作用较小。

通过响应面优化，最终确定超声提取通经草总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度56.91 %，料液比33.76:1，超声时间76.79 min，响应分析预测通经草总黄酮收率为10.51 %，结合实际操作考虑，将提取条件调整为：乙醇浓度57 %，料液比34:1，超声时间77 min。

图4 乙醇浓度和料液比对总黄酮含量影响的响应面和等高线分析图

图5 乙醇浓度和超声时间对总黄酮含量影响的响应面和等高线分析图

图6 料液比和超声时间对总黄酮含量影响的响应面和等高线分析图

3.6 验证试验

按优化后工艺条件，进行3次平行试验，测得通经草总黄酮的平均收率为10.19 %（RSD=0.19 %），与理论值相差仅为0.32 %，说明响应面法得到的最佳提取工艺有较强的可行性。该方法优化的通经草总黄酮的收率亦明显高于单变量优化所得值（Y=9.59 %）。

4 结论

通过单因素试验，考察了乙醇浓度、料液比、超声时间对通经草总黄酮收率的影响，实验结果表明乙醇浓度为60 %，料液比为30:1，超声时间为75 min时，分别达到单因素条件下通经草总黄酮收率的最佳水平。在单因素试验的基础上，以通经草总黄酮收率为指标，根据Box-Behnen中心组合试验设计原理，选择乙醇浓度、料液比、超声时间3个考察因素，设计3因素3水平响应面分析法，确定提取通经草总黄酮的最佳工艺：乙醇体积为57 %、料液比为34:1、超声时间77 min，通经草总黄酮收率达10.19 %。与传统提取工艺相比，提高了通经草总黄酮收率，为通经草的开发及利用提供了理论依据。