土荆皮化学成分及其抗黄嘌呤氧化酶活性研究

杜洪芳，贾献慧，赵焕新，肖成梅，蔡 敏，王子潇，杜成林，唐文照*

（1.济南大学 山东省医学科学院 医学与生命科学学院，山东 济南 250200；2.山东省医学科学院 药物研究所国家卫生部生物技术药物重点实验室 山东省罕少见病重点实验室，山东 济南 250062）

土荆皮又名土槿皮、荆树皮、金钱松皮，是松科植物金钱松（Pseudolarix kaempferiGord.）的干燥根皮或近根树皮，是《中华人民共和国药典》收载的常用中药，具有杀虫、止痒、治癣疥等功效，分布于江苏、安徽、浙江、江西等地长江中下游温暖地区 。研究发现土荆皮中含二萜、三萜、甾体、挥发油、有机酸和酚类化合物，其中以土荆皮乙酸（pseudolaric acid B）为主的二萜类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗炎、抗血管生成等作用[1]。

在筛选治疗痛风疾病的中草药过程中，我们发现土荆皮的乙醇提取物具有抗黄嘌呤氧化酶活性，利用柱层析法，从活性最强的乙酸乙酯部位分离得到13个化合物，主要为土荆皮二萜酸与多酚（酸）类物质，分别是土荆皮乙酸（1），土荆皮甲酸（2），土荆皮丙酸（3），土荆皮乙酸甲酯（4），土荆皮乙酸乙酯（5），土荆皮乙酸葡糖苷（6），杨梅素（7），二氢去氢二愈创木基醇（8），罗汉松脂素（9），cedrusin（10），ligraminol E（11），原儿茶酸（12），3, 5-二羟基-2-[2-（4-羟苯乙酰基）]苯甲酸 （13），其中化合物8，11，12，13为首次从金钱松植物中分离得到。黄嘌呤氧化酶抑制活性实验结果显示，除了土荆皮乙酸（1）具有一定的活性[半数抑制浓度（IC50）=0.85 mmol/L]外，其他5种土荆皮二萜酸的活性均较弱。多酚（酸）类物质的活性较高，其中化合物7，12，13的IC50分别为 0.32，0.38，0.29 mmol/L，土荆皮所含的多酚（酸）类化合物应为其抗黄嘌呤氧化酶活性的物质基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器与分离材料

Bruker AVANCE 600 MHz 核磁共振波谱仪（TMS为内标），Agilent Trap VL型质谱仪，Agilent 1200 series 高效液相色谱仪（美国安捷伦）；岛津LC-20AR型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；制备色谱柱ODS-A（21.2 mm× 250 mm，5 μm，YMC公司），C18分析色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm，美国安捷伦），柱层析硅胶，薄层色谱硅胶GF254 （青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20 （Amersham Biosciences公司）；ODS柱色谱填料（50～75 μm，YMC公司）。

1.2 药材与试剂

土荆皮于2017年10月购自济南山东建联盛嘉中药有限公司，产地为湖北荆门。黄嘌呤氧化酶（Sigma）；别嘌呤醇（阿拉丁）；黄嘌呤（阿拉丁）；甲醇，乙腈（色谱纯，Tedia），其他有机试剂均为国产分析纯。

2 实验过程

2.1 提取与分离

干燥土荆皮5 kg，粉碎，用70 %乙醇（10 L）回流提取2次，每次2 h。提取液合并，减压浓缩，得浓浸膏280 g，浓浸膏加热水溶解，依次用石油醚 （5 L）、乙酸乙酯 （5 L）和正丁醇 （5 L）各萃取3次，乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物64 g。乙酸乙酯经硅胶柱层析 （200～300目，1200 g），石油醚/乙酸乙酯（10:1→7:3）、二氯甲烷/甲醇（8:2→6:4）梯度洗脱，相同部分合并，得16个流份 （Fr.1～Fr.16），Fr.11和Fr.13用甲醇重结晶得化合物1 （1.3 g），2 （0.2 g）。Fr.4 经ODS柱层析，甲醇/水 50:50→100:0梯度洗脱，得SFr.1～10 10个流份，SFr.2再次经ODS柱层析（甲醇/水，30:70→ 100:0），制备HPLC纯化得化合物4（20 mg），6（30 mg），9（11 mg），11（23 mg）。SFr.4经重结晶得到化合物3（30 mg）。SFr.7经制备HPLC （乙腈/水，70:30）纯化得化合物5（28 mg）。Fr.7 经ODS柱层析 （甲醇/水，40:60→100:0洗脱），得SFr.1～10 10个流份，SFr.6经制备HPLC纯化（甲醇/水，55:45），得化合物7（70 mg）。SFr.3经Sephadex LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱，得4部分，其中第2部分经制备HPLC纯化（甲醇/水，40:60），得化合物12（35 mg），13（9.7 mg）。SFr.4经制备HPLC纯化（MeOH/H2O，35:75），得化合物10（60 mg）。Fr.10 再次进行硅胶柱层析 （200～300目，200 g），二氯甲烷/甲醇（10:1→7:3） 梯度洗脱，得SFr.1～44个流份，SFr.2经制备HPLC纯化（甲醇/水，75:25），得化合物8（9 mg）。

2.2 抗黄嘌呤氧化酶活性实验

本实验体外筛选化合物抗黄嘌呤氧化酶的活性采用HPLC，以反应体系中的底物黄嘌呤在反应前后的含量变化为指标，考察化合物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用，具体过程参考实验室此前建立的测定方法[2]。

3 结果

3.1 结构鉴定

化合物1：白色无定形粉末，ESI-MS：m/z433.5[M+H]+，分子式为C23H28O8，1H-NMR数据见表1，13C-NMR数据见表2，NMR数据与文献报道土荆皮乙酸数据基本一致[3]，故鉴定化合物1为土荆皮乙酸。

化合物2：白色无定形粉末，ESI-MS：m/z389.3[M+H]+，分子式为C22H28O6，1H-NMR数据见表1，13C-NMR数据见表2，NMR数据与文献报道土荆皮甲酸数据基本一致[3]，故鉴定化合物2为土荆皮甲酸。

化合物3：白色无定形粉末，ESI-MSm/z391.3[M+H]+1，分子式为C21H26O7，1H-NMR数据见表1，13C-NMR数据见表2，NMR数据与文献报道土荆皮丙酸数据基本一致[3]，故鉴定化合物3为土荆皮丙酸。

化合物4：白色无定形粉末，ESI-MSm/z：447.1[M+H]+，分子式为C24H30O8，1H-NMR数据见表3，13C-NMR数据见表2，NMR数据与文献报道的土荆皮乙酸甲酯数据基本一致[4]，故鉴定化合物4为土荆皮乙酸甲酯。

化合物5：白色无定形粉末，ESI-MSm/z：461.5[M+H]+，分子式为C25H32O8，1H-NMR数据见表3，13C-NMR数据见表2，NMR数据与文献报道土荆皮乙酸乙酯数据基本一致[5]，故鉴定化合物5为土荆皮乙酸乙酯。

化合物6：白色无定形粉末，ESI-MSm/z：617.3[M+Na]+，分子式为C29H38O13，5 %NaOH水解，薄层色谱（TLC）检出葡萄糖。苷元的1H-NMR数据见表3，13C-NMR数据见表2，葡糖基1H-NMR：δ 5.55（1H， d，J=7.8 Hz，H-1'）， 3.84（1H， dd，J=1.8，12.0 Hz，H-6a'）， 3.69（1H， dd，J=4.2，12.0 Hz，H-6b'），3.34～3.46（4H， m， H-2' - H-5'）；13C-NMR：δ 96.1（C-1'）， 74.0（C-2'）， 78.8（C-3'）， 71.1（C-4'）， 78.0（C-5'）， 62.3（C-6'），NMR数据与文献报道土荆皮乙酸葡糖苷数据基本一致[6]，故鉴定化合物6为土荆皮乙酸葡糖苷。

表1 化合物1～3的1H-NMR数据（600 MHz，氘代甲醇）

表2 化合物1～6的13C-NMR数据（150 MHz，氘代甲醇）

化合物7：淡黄色粉末，ESI-MSm/z：341.7[M+Na]+，分子式为C15H10O8，1H-NMR（600 MHz， CD3OD）：δ 6.18（1H，br.s，H-6），6.37 （1H，br.s，H-8）， 7.35 （2H，br.s，H-2'，6'）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）：δ 94.5（C-8）， 99.3 （C-6）， 104.6（C-10），108.6（C-2'，6'）， 123.2（C-1'）， 137.4（C-3）， 137.0 （C-4'）， 146.8（C-3'，5'），148.1（C-2）， 158.3（C-9）， 162.6（C-5），165.6 （C-7）， 177.4（C-4）。NMR数据与文献报道的杨梅素基本一致[7]，故鉴定化合物7为杨梅素。

化合物8：白色无定形粉末，ESI-MSm/z：383.3[M+Na]+，分子量为360，分子式为C20H24O6，1H-NMR数据（600 MHz，氘代甲醇）与13C-NMR（150 MHz，氘代甲醇）数据见表4，NMR数据与文献报道的二氢去氢二愈创木基醇数据基本一致[8]，故鉴定化合物8为二氢去氢二愈创木基醇。

化合物9：白色无定形粉末，ESI-MSm/z：381[M+Na]+，分子量为358，分子式为C20H22O6，1H-NMR数据（600 MHz，氘代甲醇）与13C-NMR（150 MHz，氘代甲醇）数据见表4，NMR数据与文献报道的罗汉松脂素数据基本一致[9]，故鉴定化合物9为罗汉松脂素。

表3 化合物4～6的1H-NMR数据（600 MHz，氘代甲醇）

化合物10：白色无定形粉末，ESI-MSm/z：355.7[M+Na]+，分子量为332，分子式为C19H22O6，1H-NMR数据（600 MHz，氘代甲醇）与13C-NMR（150 MHz，氘代甲醇）数据见表4，NMR数据与文献报道的cedrusin 数据基本一致[10]，故鉴定化合物10为cedrusin。

化合物11：白色无定形粉末，ESI-MSm/z：385.3[M+Na]+，分子量为362，分子式为C20H26O6，1H-NMR数据（600 MHz，氘代甲醇）与13C-NMR（150 MHz，氘代甲醇）数据见表4，NMR数据与文献报道的ligraminol E数据基本一致[11]，故鉴定化合物11为ligraminol E。

化合物 12：白色无定形粉末，溶于甲醇；ESI-MSm/z：155 .2[M+H]+，分子式 C7H6O4。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）：δ 7.44（1H，br.s，H-2）， 7.42 （1H，J=7.8 Hz，H-6），6.80（1H，d，J=7.8 Hz，H-5）。与文献数据对比[12]，并与原儿茶酸对照品薄层色谱比较，Rf值一致，故鉴定化合物12 为原儿茶酸。

化合物 13：白色无定形粉末，溶于甲醇；ESI-MSm/z：289.4[M + H]+，分子式 C15H12O6。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）：δ 7.00（2H，d，J=7.2 Hz， H-2'，6'），6.58（2H，d，J=7.2 Hz，H-3'，5'），5.75（1H，br.s，H-6），5.72（1H，br.s，H-4），3.05（2H，s，H-8）；13C-NMR（150 MHz， CD3OD）：δ 103.1（C-1）， 107.5（C-2）， 159.8（C-3）， 96.7（C-4）， 171.1（C-5）， 91.2（C-6）， 196.9 （C-7）， 42.8（C-8）， 173.8（C-9）， 125.8（C-1'）， 132.6（C-2'，6'）， 115.8（C-3'，5'），157.3（C-4'）。NMR数据与文献报道的3， 5-二羟基-2-[2-（4-羟苯乙酰基]苯甲酸数据基本一致[13]。

3.2 黄嘌呤氧化酶抑制活性

采用HPLC，以酶促反应体系中底物黄嘌呤在反应前后的含量变化为指标，比较各化合物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用。结果显示，以别嘌呤醇为阳性对照（IC50：0.053 mmol/L），除土荆皮乙酸（1）具有一定的活性外（IC50： 0.45 mmol/L），其他5种土荆皮二萜酸的活性均较弱。多酚（酸）类物质的活性较高，化合物7～13的IC50值分别为0.32，0.45， 0.48， 0.43， 0.40， 0.38， 0.29 mmol/L，以7， 12， 13的活性较好。

表4 化合物8～11的1H-NMR与13C-NMR数据

4 讨论

土荆皮是一味传统中草药，中医临床用于疥癣瘙痒的治疗，我们发现其具有一定的抑制黄嘌呤氧化酶的活性。活性较好的乙酸乙酯萃取物经成分分离与结构鉴定发现，其主要含土荆皮二萜酸与多酚（酸）类物质，其中多酚（酸）类物质的活性高于土荆皮的代表性成分二萜酸类物质，应为其抗黄嘌呤氧化酶活性的物质基础，这可能与多酚（酸）类物质具有的抗氧化活性有关。土荆皮二萜酸具有反式环合薁骈合六元内酯环的结构骨架，结构新颖，土荆皮乙酸在药材中的含量较高，国内外对其进行了较深入的抗炎与抗肿瘤活性研究，我们首次发现其具有一定的抗黄嘌呤氧化酶的活性，值得对其进行结构修饰，有希望发现活性增强的土荆皮乙酸衍生物。

目前体外筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法主要采用紫外分光光度法，由于供试物大多具有紫外吸收，筛选结果准确度不高，有时会出现假阳性或假阴性结果，本文利用HPLC对底物黄嘌呤反应前后含量的变化进行测定，计算待测样品的抑制率，与紫外分光光度法相比较，准确性较高，更能真实反映供试物的活性强弱。