复方甲巯咪唑软膏在大鼠体内的药动学研究

房绍英，邵华荣，黄艳妮，程艳玲*，江 婷

（1.山东省药学科学院，山东 济南 250101；2.山东省分析测试中心，山东 济南 250101）

甲巯咪唑为临床常用抗甲状腺药物，用于各种类型的甲状腺功能亢进症，因口服给药可出现血液系统异常等不良反应[1-2]，目前已开发甲巯咪唑软膏，通过局部用药来提高药物疗效、降低不良反应。复方甲巯咪唑软膏的有效药物成分是甲巯咪唑和氢化可的松，具有抑制过氧化酶和碘吸收的双重作用，可阻止甲状腺激素合成，有利于增强对甲亢的控制[3]。目前对复方甲巯咪唑软膏的研究多集中于作用机制研究及临床疗效观察[4-5]，尚无对复方甲巯咪唑软膏的临床前药动学研究。本文建立了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）及高效液相色谱法（HPLC）测定大鼠血清及甲状腺组织中甲巯咪唑浓度，研究复方甲巯咪唑软膏在大鼠体内的药动学性质，了解甲巯咪唑的体内过程及复方与单方制剂主要药动学参数的差异，为临床合理应用复方甲巯咪唑软膏提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent1100型高效液相色谱仪，包括紫外检测器（美国安捷伦）；Agilent1200型高效液相色谱仪，配备Agilent 6430型三重串联四级杆质谱检测器（美国安捷伦）；LG10-2.4A型离心机（北京医用离心机厂）；XK96-A型快速混匀器（姜堰新康医疗器械公司）；N-EVAP型氮吹仪（Organomation Associates Inc.）。

1.2 药品与试剂

甲巯咪唑对照品（中国食品药品检定研究院，批号：0030-9703）；对乙酰氨基酚标准品（中国食品药品检定研究院，批号：100018-200107）；复方甲巯咪唑软膏[山东省药学科学院，甲巯咪唑5 %（w/w），氢化可的松0.5 %（w/w），批号：070318-4]；甲巯咪唑软膏（山东省药学科学院，甲巯咪唑5 %（w/w），批号：070318-2）；甲醇，乙腈，甲酸，乙酸铵（色谱纯，美国Tedia公司）；其他试剂均为分析纯。

1.3 实验动物

Wistar大鼠，240只，雌雄各半，由山东大学实验动物中心提供。大鼠购进后进行1周预饲养，用于试验时体重200～240 g。动物均饲养于SPF级环境，室温19～26 ℃，湿度40 %～70 %，日温差≤4 ℃，换气次数8～10次/h，昼夜明暗交替时间12 h/12 h。大鼠用金属笼饲养，每笼不多于5只，自由饮水，给予颗粒饲料。大鼠颗粒饲料由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。

2 方法与结果

2.1 样品采集

将240只大鼠按体重随机分成4组：复方甲巯咪唑软膏高、中、低剂量（分别为25，9，1.5 mg/kg，按甲巯咪唑含量计）组及单方甲巯咪唑软膏（9 mg/kg）组，每组60只。试验前于大鼠颈部涂抹10 %硫化钠脱毛剂，1 d后开始给予不同剂量的复方甲巯咪唑软膏、5 %甲巯咪唑软膏。分别于给药后0.5，1，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0 h，每组取6只动物，颈动脉取血5 ml，3000 r/min离心20 min，取血清，冷冻贮存备测。同时将大鼠处死后取甲状腺组织。甲状腺经滤纸吸干后称重，然后置烧杯中剪碎，加入生理盐水制备匀浆，冷冻贮存备测。

2.2 色谱质谱条件[6-8]

2.2.1 复方甲巯咪唑软膏高、中剂量组及单方组大鼠血清测定条件 Agilent高效液相色谱仪；流动相：甲醇-水=10:90（v/v），0.45 μm微孔滤膜过滤，在线脱气；流速1 ml/min，不分流；色谱柱：XDB-C18柱（5.0 mm×250 mm，4.6 μm），柱温：35 ℃；进样量：20 μl；可变波长检测器（VWD）检测波长：254 nm。

2.2.2 复方甲巯咪唑软膏低剂量组大鼠血清及大鼠的甲状腺组织测定条件 Agilent色谱串联质谱联用仪，流动相：乙腈-缓冲液（含0.1 %醋酸和5 mmoL甲酸铵）=15:85（v/v），0.45 μm微孔滤膜过滤，在线脱气，流速0.3 ml/min，不分流；色谱柱：SB-C18柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），柱温：35 ℃，进样量：5 μl；检测器离子源：电喷雾电离（ESI），正离子模式，雾化压力38 psi，保护气为氮气，流速11 L/min；毛细管电压4000 V，采集方式为多重反应监测（MRM）模式；甲巯咪唑母离子m/z=115.0（M+H），碎裂电压为100 V，子离子为88.0，57.1，碰撞电压（CE）=20 V，内标对乙酰氨基酚母离子m/z=152.1（M+H），碎裂电压为100 V，子离子为110.1，65.2，CE=20 V。

2.3 样品处理

2.3.1 复方甲巯咪唑软膏高、中剂量组及单方组大鼠血清样品处理 准确吸取待测血清0.5 ml，置入10 ml干净离心管，加乙腈5 ml，充分振荡萃取2 min，4000 r/min离心，分离有机相，取有机相3.5 ml，用氮气吹干溶剂，残留物用100 μl流动相溶解，进样10 μl分析，外标法定量。

2.3.2 复方甲巯咪唑软膏低剂量组大鼠血清样品处理 准确吸取待测血清0.5 ml，置入10 ml干净离心管，加内标对乙酰氨基酚（1 μg/ml）100 μl，加三氯甲烷5 ml，充分振荡萃取2 min，4000 r/min离心，分离有机相，取有机相3.5 ml，用氮气吹干溶剂，残留物用100 μl流动相溶解，进样20 μl分析，内标法定量。

2.3.3 各组甲状腺样品处理 准确吸取待测甲状腺组织匀浆液0.5 ml置10 ml干净离心管中，加入内标对乙酰氨基酚（1 μg/ml）100 μl，加三氯甲烷5 ml，充分振荡萃取15 min，离心后分离有机相，取有机相3.5 ml，用氮气吹干溶剂，残留物用100 μl流动相溶解，供分析使用。

2.4 对照品储备液及内标溶液的配制

2.4.1 甲巯咪唑储备液的配制 精密称取甲巯咪唑10.08 mg，置入100 ml量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成甲巯咪唑浓度为100 μg/ml的储备液。将储备液稀释获得系列标准溶液。

2.4.2 内标溶液的配制 精密称取对乙酰氨基酚10.02 mg，置入100 ml量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成浓度为100 μg/ml的储备液，将储备液稀释获得浓度为1 μg/ml的内标溶液。

2.5 标准曲线及定量下限测定

2.5.1 复方甲巯咪唑软膏高、中剂量组及单方组线性范围考察 取空白血清0.5 ml，分别加入甲巯咪唑系列标准溶液10 μl，制备甲巯咪唑浓度为0.1，0.2，0.5，1，2，5，10 μg/ml的样品，准确吸取0.5 ml，加乙腈5 ml，按2.3.1项下方法处理，以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积为纵坐标，求得线性回归方程，结果为：Y=809.38X+386.64，r=0.9936。根据标准曲线，甲巯咪唑的线性范围为0.1～10 μg/ml。定量下限为0.1 μg/ml。

2.5.2 复方甲巯咪唑软膏低剂量组线性范围考察 取空白血清0.5 ml，分别加入甲巯咪唑标准溶液10 μl，制备甲巯咪唑浓度为5，10，20，50，100，200 ng/ml的样品，准确吸取0.5 ml，按2.3.2项下方法操作，以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，求得线性回归方程，结果为：Y=1.2597X-0.0409，r=0.9920。根据标准曲线，甲巯咪唑的线性范围为5～200 ng/ml。定量下限为5 ng/ml。

2.5.3 各组甲状腺组织线性范围考察 取空白甲状腺组织匀浆液，分别加入甲巯咪唑标准溶液10 μl，制备甲巯咪唑浓度为5，10，50，100，200，500，1000 ng/mg的样品，准确吸取0.5 ml，按2.3.3项下方法操作，以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，求得线性回归方程，结果为：Y=0.8011X-0.2343，r=0.9944。根据标准曲线，甲巯咪唑的线性范围为5～1000 ng/mg。定量下限为5 ng/mg。

2.6 精密度考察

2.6.1 复方甲巯咪唑软膏高、中剂量组及单方组精密度考察 取空白血清0.5 ml，分别加入甲巯咪唑标准溶液10 μl，制备低、中、高3个浓度（0.1，2，10 μg/ml）的样品，准确吸取0.5 ml，按2.3.1项下方法操作，每一浓度进行5样本分析，连续配制分析3 d，以标准曲线计算甲巯咪唑的浓度，统计批内精密度RSD＜11.22 %，批间精密度RSD＜10.30%，准确度（RE）范围为87.56 %～111.16 %。

2.6.2 复方甲巯咪唑软膏低剂量组精密度考察 取空白血清0.5 ml，分别加入甲巯咪唑标准溶液10 μl，制备低、中、高3个浓度（5，50，200 ng/ml）的样品，准确吸取0.5 ml，按2.3.2项下方法操作，每一浓度进行5样本分析，并连续配制分析3 d，以标准曲线计算甲巯咪唑的浓度，批内精密度RSD＜8.90 %，批间精密度RSD＜6.79 %，准确度（RE）范围为91.00 %～103.83 %。

2.6.3 各组甲状腺组织精密度考察 取空白甲状腺组织匀浆液，分别加入甲巯咪唑标准溶液10 μl，配制低、中、高3个浓度（5，200，1000 ng/mg）的样品，准确吸取0.5 ml，按2.3.3项下依法操作，每一浓度进行5样本分析，连续配制分析3 d，以标准曲线计算甲巯咪唑的浓度，批内精密度RSD＜12.67 %，批间精密度RSD＜10.23 %，准确度（RE）范围为88.33 %～111.73 %。

2.7 回收率考察

2.7.1 复方甲巯咪唑软膏高、中剂量组及单方组回收率考察 取空白血清0.5 ml，分别加入甲巯咪唑标准溶液10 μl，制备低、中、高3个浓度（0.1，2，10 μg/ml）的样品，准确吸取0.5 ml，按2.3.1项方法操作，每一浓度进行5样本分析，处理后进样检测；另取空白血清同法处理，向获得的上清加入相应浓度的标准溶液。以每一浓度两种处理方法峰面积比值计算回收率，计算相对回收率为86.80 %～89.58 %。

2.7.2 复方甲巯咪唑软膏低剂量组回收率考察 取空白血清0.5 ml，分别加入甲巯咪唑标准溶液10 μl，制备低、中、高3个浓度（5，50，200 ng/ml）的样品，准确吸取0.5 ml，按2.3.2项下方法操作，每一浓度进行5样本分析，处理后进样检测；另取空白血清同法处理，向获得的上清液加入相应浓度的内标和标准溶液。以每一浓度两种处理方法峰面积比值计算回收率，计算相对回收率为91.00 %～101.21 %。

2.7.3 各组甲状腺组织回收率考察 取空白甲状腺组织匀浆液，分别加入甲巯咪唑标准溶液10 μl，配制低、中、高3个浓度（5，200，1000 ng/mg）的样品，准确吸取0.5 ml，按2.3.3项下方法操作，每一浓度进行5样本分析，处理后进样检测；另取空白匀浆液同法处理，向获得的上清液加入相应浓度的内标和标准溶液。以每一浓度两种处理方法峰面积比值计算回收率，计算相对回收率为88.33 %～108.97 %。

2.8 稳定性考察

2.8.1 预处理后室温放置24 h稳定性考察

2.8.1.1 复方甲巯咪唑软膏高、中剂量组及单方组稳定性考察 将进样器内批内精密度样本常温放置24 h，再次进样，按标准曲线计算甲巯咪唑浓度，结果准确度（RE）范围为93.84 %～112.60 %。

2.8.1.2 复方甲巯咪唑软膏低剂量组稳定性考察 将进样器内批内精密度样本常温放置24 h，再次进样，按标准曲线计算甲巯咪唑浓度，结果准确度（RE）范围为94.85 %～97.63 %。

2.8.1.3 各组甲状腺组织稳定性考察 将进样器内批内精密度样本常温放置24 h，再次进样，按标准曲线计算甲巯咪唑浓度，结果准确度（RE）范围为104.38 % ～108.34 %。

2.8.2 -20 ℃放置100 d冻融稳定性考察

2.8.2.1 复方甲巯咪唑软膏高、中剂量组及单方组稳定性考察 取空白血清0.5 ml，分别加入甲巯咪唑标准溶液10 μl，制备低、中、高3个浓度（0.1，2，10 μg/ml）的样品，-20 ℃放置100 d，解冻后，准确吸取0.5 ml，按2.3.1项下方法操作，按标准曲线计算甲巯咪唑浓度，结果准确度（RE）范围为91.33 %～116.33 %。

2.8.2.2 复方甲巯咪唑软膏低剂量组稳定性考察 取空白血清0.5 ml，分别加入甲巯咪唑标准溶液10 μl，制备低、中、高3个浓度（5，50，200 ng/ml）的样品，-20 ℃放置100 d，解冻后，准确吸取0.5 ml，按2.3.2项下方法操作，按标准曲线计算甲巯咪唑浓度，结果准确度（RE）范围为102.33 %～105.47 %。

2.8.2.3 各组甲状腺组织稳定性考察 取空白甲状腺组织匀浆液，分别加入甲巯咪唑标准溶液10 μl，配制低、中、高3个浓度（5，200，1000 ng/mg）的样品，-20 ℃放置100 d，解冻后，准确吸取0.5 ml，按2.3.3项下方法操作，按标准曲线计算甲巯咪唑浓度，结果准确度（RE）范围为96.36 %～100.43 %。

2.9 数据处理

根据所测甲巯咪唑血清、甲状腺药物浓度-时间数据，采用DAS2.1.1软件计算以下药动学参数：t1/2、Vd、CL、AUC0-t、AUC0-∞、Cmax、Tmax等，除Cmax和Tmax为实测值外，其余参数均为统计矩参数。利用SPSS16.0对各组的药动学参数进行单因素方差分析，P值小于0.05代表差异有统计学意义。

2.10 大鼠血清及甲状腺组织药物浓度-时间数据

大鼠涂抹不同剂量的复方甲巯咪唑软膏及单方甲巯咪唑软膏，经HPLC或LC-MS/MS分析后，不同剂量组及单方组的血清/甲状腺药物浓度-时间数据见图1～图3。

图1 复方甲巯咪唑软膏高、中剂量组、单方甲巯咪唑软膏组（9 mg/kg）大鼠血清甲巯咪唑药时曲线

图2 复方甲巯咪唑软膏低剂量组（1.5 mg/kg）大鼠血清甲巯咪唑药时曲线

图3 复方甲巯咪唑软膏高、中、低剂量组及单方甲巯咪唑软膏组（9 mg/kg）大鼠甲状腺组织中甲巯咪唑药时曲线

2.11 主要药动学参数及统计

大鼠单次颈部涂抹复方甲巯咪唑软膏高、中、低剂量及单方甲巯咪唑软膏后甲巯咪唑在血清中的主要药动学参数见表1，在甲状腺组织中的主要药动学参数见表2。

甲巯咪唑在大鼠体内吸收迅速，血清浓度达峰时间约为2.0 h，甲状腺浓度达峰时间约为1.3 h，血清消除半衰期约为2.4 h，甲状腺消除半衰期约为4.6 h。由统计学结果可知，复方甲巯咪唑软膏的高、中、低剂量之间，血清及甲状腺组织中，除AUC、Cmax外其余参数差异均无统计学意义，相同剂量下，复方给药与单方给药相比，血清中甲巯咪唑的Tmax存在差异，其余参数差异并无统计学意义。与单方组比较，复方中剂量组给药后甲巯咪唑在血清中的相对生物利用度为58.52 %，在甲状腺组织中的相对生物利用度为80.62 %。

3 讨论

与HPLC相较，液质联用技术灵敏、快速、高效，更适用于药物代谢研究，但本试验中由于部分样本浓度偏高，需采用空白基质稀释后测定，稀释10倍以上即存在稀释效应致使准确度偏离，因此本研究针对不同浓度水平的生物样本分别采用HPLC及LC-MS/MS进行测试，建立了两种分析方法并分别进行验证，保证样本检测的准确性。

针对甲状腺组织的前处理，由于单只大鼠甲状腺体积小不易匀浆，而甲巯咪唑易溶于三氯甲烷，本试验中称量甲状腺组织直接加入三氯甲烷振荡萃取，并相应延长萃取时间，方法学验证表明此种固液萃取方法甲巯咪唑提取回收率可满足分析需求。

表1 大鼠颈部涂抹复方甲巯咪唑软膏高、中、低剂量及单方甲巯咪唑软膏后甲巯咪唑在血清中的主要药动学参数（n=6, ）

表1 大鼠颈部涂抹复方甲巯咪唑软膏高、中、低剂量及单方甲巯咪唑软膏后甲巯咪唑在血清中的主要药动学参数（n=6, ）

注：*P＜0.05 vs 复方甲巯咪唑软膏中剂量组，**P＜0.01 vs 复方甲巯咪唑软膏中剂量组

单方甲巯咪唑软膏组AUC0-12 h/mg·(L·h)-1 38.24±7.12** 10.37±3.10 0.25±0.07** 15.32±4.96药动学参数复方甲巯咪唑软膏高剂量组复方甲巯咪唑软膏中剂量组复方甲巯咪唑软膏低剂量组AUC0-∞/mg·(L·h)-1 61.95±23.33** 11.13±3.51 0.33±0.21** 19.02±3.94 t1/2/h 2.73±1.28 1.64±1.02 2.25±1.54 3.06±1.29 Tmax/h 2.25±1.17 1.33±1.44* 1.75±0.69 2.83±1.13 Vd/L·kg-1 3.19±0.69 1.84±0.97 2.70±1.77 2.28±1.41 CL/L·(h·kg)-1 0.46±0.18 0.89±0.31 0.76±0.26 0.49±0.11 Cmax/mg·L-1 9.50±1.43** 2.88±0.43 0.07±0.01** 3.78±0.36

表2 大鼠颈部涂抹复方甲巯咪唑软膏高、中、低剂量及单方甲巯咪唑软膏后甲巯咪唑在甲状腺中的主要药动学参数（n=6, ）

表2 大鼠颈部涂抹复方甲巯咪唑软膏高、中、低剂量及单方甲巯咪唑软膏后甲巯咪唑在甲状腺中的主要药动学参数（n=6, ）

注：**P＜0.01 vs 复方甲巯咪唑软膏中剂量组

单方甲巯咪唑软膏组AUC0-12h /ng·(mg·h)-1 221.91±42.74** 117.17±25.22 75.23±12.75** 139.28±35.31 AUC0-∞ /ng·(mg·h)-1 288.65±57.01** 145.08±35.48 109.83±21.14** 179.96±48.83 t1/2/h 3.89±1.19 4.13±2.02 5.25±3.54 5.10±2.97 Tmax/h 1.50±0.32 1.00 1.25±0.61 1.50±0.63 Vd/mg·kg-1 465.67±189.67 346.93±190.12 317.63±116.33 325.95±191.71 CL/mg·(h·kg)-1 49.73±19.08 55.32±16.70 54.23±25.73 45.74±15.09 Cmax/ng·mg-1 63.29±9.60** 32.34±10.20 20.71±6.09** 42.33±10.71药动学参数 复方甲巯咪唑软膏高剂量组复方甲巯咪唑软膏中剂量组复方甲巯咪唑软膏低剂量组

大鼠颈部皮肤给予高、中、低剂量复方甲巯咪唑软膏后，血清及甲状腺组织中甲巯咪唑浓度呈现剂量依赖性，其AUC与剂量呈现剂量相关性，提示甲巯咪唑在大鼠体内呈现线性动力学特征，与文献报道相符[6]。相同剂量下，复方甲巯咪唑软膏与单方制剂相比，靶部位及血清药物暴露水平接近，除达峰时间更早外其余药动学参数无差异，说明复方制剂中氢化可的松对甲巯咪唑的药代动力学特征影响小，两者可配伍协同发挥药效。