妊娠期糖尿病患者血浆miR-340水平检测及其与胰岛素抵抗关系

杨筱青 赵莉莉 张瑞丽 郭华峰

河南省郑州市妇幼保健院(450000)

妊娠期糖尿病发病率较高，妊娠期间血糖过高可导致妊娠期高血压等并发症[1]。胰岛素抵抗和胰岛β 细胞分泌降低被认为是GDM发病机制的重要环节[2]。越来越多研究证明miRNA直接或间接参与糖尿病的发病机制，在胰岛细胞发育、糖代谢等过程中均发挥主要作用[3-4]。现有研究显示2型糖尿病患者血浆miRNA表达异常升高，对糖尿病起到预警作用[5]。由于外周血miRNA表达稳定，而胰腺组织标本中较难获得，因此研究外周血浆miRNA的表达对糖尿病诊治意义重大。目前鲜有GDM患者血浆miRNA表达水平的报道。鉴于此，本研究进行血浆miRNA检测，探讨其水平与GDM患者胰岛素抵抗的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

GDM诊断参照美国糖尿病学会标准[6]。纳入标准：妊娠>16周；在本院规律产检；资料完整；知情同意本研究。排除妊娠期高血压、心脏病等其他妊娠合并症、不配合本研究、终止妊娠等。按参考文献[7]将GDM患者分为胰岛素抵抗组(HOMA-IR≥1.66)和非胰岛素抵抗组(HOMA-IR<1.66)。

1.2 方法

1.2.1标本采集所有受试者均于清晨采集空腹静脉血取血清， -20℃待检。

1.2.2生化指标检测采用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FPG)和2h血糖(2hPG)；采用放射免疫法测定空腹胰岛素(FINS)和2h胰岛素(PINS)，试剂盒为中国原子能科学研究院提供。稳态模型计算HOMA-胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=(FBG×FINS)/22.5，HOMA-胰岛素分泌指数(HOMA-IS)=[(20×FINS)/FPG-3.5]。

1.2.3血浆miR-340水平检测①试剂：Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，定量7500 PCR仪购自美国ABI公司，逆转录系统(Reverse Transcription Kit)购自美国GIBICOL公司。引物设计软件为Primer Premier 5.0，引物合成由金斯瑞生物科技有限公司完成。②RNA提取：提取液提取淋巴细胞加1ml TRIzol试剂匀浆处理，室温放置5min，待核酸蛋白复合物完全分离后，2～8℃10000×g离心10min取上清，加入0.2ml氯仿振荡15s，室温置3min，2～8℃10000×g离心15min，取无色水相层，异丙醇沉淀水相中RNA，2～8℃ 10000×g离心10min取沉淀物，75%乙醇洗涤RNA沉淀，2～8℃ 7500×g离心5min弃上清，室温置RNA沉淀物至干燥，紫外分光光度法鉴定RNA纯度和完整性。③RNA反转录反应(RT-PCR)：Reverse Transcription Kit将RNA逆转录为cDNA，利用实时定量PCR系统进行RT-PCR反应，行琼脂糖凝胶电泳，以U6分别作为miRNA的内参作对照，紫外灯下观察结果。2-ΔΔCt法计算miR-340相对表达量。RT-PCR反应条件：95℃ 30 s，95℃ 15 s，72℃ 15 s，共40个循环。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 孕妇血清miR-340的表达

共纳入116例研究对象，其中GDM组56例，非GDM组60例。GDM组孕妇血清miR-340水平(0.61±0.09)高于非GDM组孕妇(0.10±0.02)(t=7.305，P=0.000)。

2.2 GDM孕妇胰岛素抵抗与miR-340表达

GDM组孕妇中胰岛素抵抗30例，非胰岛素抵抗26例，胰岛素抵抗孕妇血清miR-340表达(0.91±0.12)高于非胰岛素抵抗孕妇(0.25±0.06)(t=3.524，P=0.005)。

2.3 miR-340与GDM患者胰岛素抵抗相关性

GDM组孕妇中，胰岛素抵抗患者血浆miR-340水平与FPG、HOMA-IR呈正相关，与FINS、HOMA-IS呈负相关(均P<0.05)；非胰岛素抵抗患者血浆miR-340水平与FPG、FINS、HOMA-IR、HOMA-IS无关，见表1。

表1 胰岛素抵抗与各指标相关性

3 讨论

新确诊糖尿病患者胰岛β细胞功能下降达90%，数量下降50%，若及时干预发挥剩余50%胰岛β细胞的功能，患者可达到较好的血糖控制水平，延缓胰岛β细胞功能衰竭进程，降低并发症的发生和进展[8]。因此寻找GDM早期诊断指标，对改善围产期妊娠结局有重要意义。

miRNA被多数研究证实参与多种病理生理过程[9-10]。有研究[11]发现miRNA不仅参与糖尿病糖和脂肪代谢，同时影响胰岛细胞的发育，其中miR-124a是维持正常胰岛素细胞发育的重要条件，miR-375在胰岛细胞中高表达可抑制葡萄糖诱导的胰岛素分泌。对动物研究[12]显示，miR-29在糖尿病大鼠模型中高度表达于胰岛素靶器官，并诱导胰岛素抵抗的发生。

miRNA-430被多数研究证实在乳腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤等实体肿瘤组织异常高度表达，且与肿瘤的恶化程度、浸润和转移有关，并且参与多种肿瘤的发生发展过程，是预测恶性肿瘤预后的生物学标记物[13-15]。然而几乎没有miRNA-430与糖尿病或GDM的相关研究。为明确miRNA-430在GDM的表达特点，分析与GDM胰岛素抵抗的相关性，本研究以GDM孕妇为观察对象，检测其外周血miRNA-430的表达特点，结果显示GDM孕妇血浆miRNA-430表达高于非GDM孕妇，提示miRNA-430在GDM的发生过程中有一定作用。

胰岛素抵抗水平是糖尿病胰岛细胞功能的一个重要指标，研究血浆miRNA-430与GDM胰岛素抵抗的相关性，对于明确GDM的发病机制有一定的借鉴意义。本研究对比了GDM患者胰岛素抵抗孕妇和非胰岛素抵抗孕妇外周血浆miRNA-430表达情况，显示胰岛素抵抗GDM孕妇外周血浆miRNA-430表达高于非胰岛素抵抗GDM孕妇，提示miRNA-430在GDM胰岛β细胞功能衰竭进程中起到关键作用，同时也说明miRNA-430可能通过抑制胰岛素分泌直接或间接参与了GDM的发生和发展，但具体机制尚需研究证实。本研究相关性分析显示，GDM胰岛素抵抗组血浆miR-340表达水平与FPG、HOMA-IR呈正相关，与FINS、HOMA-IS呈负相关，说明GDM患者血浆miR-340表达随着胰岛素抵抗水平升高而升高，随着胰岛素分泌能力升高而降低。提示临床通过干预miR-340表达来阻止其对胰岛细胞功能的抑制，逆转胰岛功能衰退可能成为GDM或糖尿病治疗的新方向。

综上，本研究认为GDM患者外周血浆miR-340表达增高，且表达水平随着GDM患者胰岛素抵抗而升高，miR-340可能作为GDM早期诊断和预后的预测指标。但由于本研究纳入GDM患者样本过少，同时缺乏同类研究，miR-340在GDM的发病机制中的作用仍需更多样本、多中心研究来证实。