不同甲酯化方法分析羊肉膻味脂肪酸

李秋桐，苏伟，母应春

(贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵阳 550025)

肉类及其制品是人类饮食构成的重要组成部分，尤其是高蛋白、低脂肪和低胆固醇的羊肉，其消费需求量随着人们生活水平的提升不断凸显[1，2]。贵州省羊产业主要以肉食为主，存栏羊中山羊占95%，绵羊占5%[3]，主要品种包括白山羊、黑山羊、黔北麻羊和晴隆绵羊等。但羊肉产量仅占肉类总产量的2.1%，且肉羊产业仍面临着一系列问题，其中很大一个因素是羊肉特有的“膻味”，一定程度上降低了人们对羊肉的可接受程度，不利于羊肉市场的发展。

Brennand等[4]对羊肉的膻味进行了研究，发现羊肉的这种特征风味物质主要来源于脂肪组织。脂肪酸的组成会对肉品的风味产生一定影响，8～10个碳原子的不饱和脂肪酸对羊肉的风味影响很大，特别是4-甲基辛酸和4-乙基辛酸是引起羊肉膻味的主要脂肪酸[5，6]。4-甲基辛酸，具有蜡样的猪肉、牛肉和焙烤羔羊的脂肪香气，并有奶油、牛奶和内酯香韵，是羊肉的特征香气成分[7]。4-乙基辛酸俗称羊油酸，它存在于煮羊肉、烤羊肉、羊脂肪、山羊奶酪、绵羊奶酪、广木香、弗吉尼亚烟草中[8]。因此，对这两种脂肪酸进行测定，对研究羊肉的膻味形成机理及除膻技术具有特殊意义。

低级的脂肪酸通常为无色、有刺激性气味的液体，具有一定的挥发性，需要将其衍生成脂肪酸甲酯才能检测[9]。但脂肪酸甲酯化方法众多，不同的方法适用于不同的脂肪酸。目前动植物油脂的脂肪酸甲酯制备主要参照GB 5009.168—2016进行，将提取出的游离脂肪在三氟化硼-甲醇等催化下生成脂肪酸甲酯，采用气相色谱法测定。丁艳艳等[10]在脂肪样品中加入NaOH溶液和混有内标的乙醚溶液，置入烘箱中皂化2 h，用H2SO4溶液调节pH至酸性，同时用蒸馏装置对4-甲基辛酸和4-甲基壬酸进行萃取，测定不同品种绵羊的膻味物质。目前为止，有关4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的甲酯化方法鲜有报道。

因此，本试验对4-甲基辛酸和4-乙基辛酸采用6种不同的甲酯化方法进行研究，并筛选出适合羊肉中4-甲基辛酸和4-乙基辛酸甲酯化处理的方法。以期为研究羊肉膻味物质及除膻技术提供技术支撑，为推动贵州肉羊产业奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验脂肪样品：分别采自于白山羊、黑山羊、黔北麻羊和晴隆绵羊，均为周岁雄性羊后腿皮下脂肪组织，每个样品质量约为100 g。

4-甲基辛酸、4-乙基辛酸标准液(纯度≥98.0%)：美国Sigma公司；甲醇、正己烷(色谱纯)：美国天地有限公司；三氟化硼-甲醇溶液(纯度14%)：上海麦克林生化科技有限公司；氢氧化钾、氢氧化钠(分析纯)：成都金山化学试剂有限公司；浓硫酸(分析纯)：重庆川东化工有限公司；超纯水。

Trace DSQ气质联用仪 美国Finnigan公司；HP-FFAP色谱柱(50 m×0.20 mm，0.25 μm) 美国安捷伦科技有限公司；N-1100旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；XW-80涡旋振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；TGL20M离心机 长沙迈佳森仪器设备有限公司；NAI-DCY-12GD氮吹仪 上海那艾精密仪器有限公司；DK-98-II恒温水浴箱 天津泰斯特仪器有限公司；FA2004N电子天平 上海青海仪器有限公司；0.22 μm有机滤膜 天津市领航实验设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 脂肪的提取

试验前将各样品脂肪绞碎，以5000 r/min均质化5 min，用锡箔纸包好置于冰箱-8 ℃下保存，备用。分别称取均质化后的脂肪样品5.0 g，用滤纸包好后放入索氏提取器中，以石油醚为溶剂，在60 ℃恒温条件下连续抽提6 h。用旋转蒸发仪除去提取物中的有机溶剂，得到透明浓稠状的粗脂肪油。

1.2.2 标准品溶液的配制

准确称取4-甲基辛酸和4-乙基辛酸各100.0 mg，混合并用正己烷定容至50 mL，即为脂肪酸标准溶液。准确量取标准溶液100，200，500，1000，2000，5000 μL至25 mL容量瓶中，用正己烷定容，配制成两种脂肪酸浓度分别为8，16，40，80，160，400 μg/mL不同梯度的混合标准溶液。

1.2.3 4 mol/L氢氧化钠-甲醇法

参照GB 5413.36—2010《婴幼儿食品和乳品中反式脂肪酸的测定》进行甲酯化。准确吸取400 μg/mL脂肪酸标准溶液5.0 mL于15 mL具塞试管中，加入4 mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液0.5 mL。塞紧试管塞，在涡旋振荡仪上剧烈振摇2 min，振荡后置于离心机以4000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm有机滤膜，转入进样瓶中，待测定。

1.2.4 0.4 mol/L氢氧化钠-甲醇法

准确吸取400 μg/mL脂肪酸标准溶液5.0 mL于150 mL锥形瓶中，依次加入正己烷10 mL和0.4 mol/L氢氧化钠-甲醇溶液10 mL，塞紧瓶口，于涡旋振荡仪上振摇2 min，使其充分混匀。室温下静置30 min，加入10 mL超纯水再次振摇5 min，静置分层后取上清液过0.22 μm有机滤膜，转入进样瓶中，待测定[11]。

1.2.5 1%硫酸-甲醇法

准确吸取400 μg/mL脂肪酸标准溶液5.0 mL于15 mL具塞试管中，加入1%硫酸-甲醇溶液2 mL，摇匀后置于70 ℃恒温水浴箱中加热30 min。取出后冷却至室温，加入2 mL正己烷，再加入超纯水至试管口，取出上清液。再用1 mL正己烷洗涤1次，合并上清液过0.22 μm有机滤膜，转入进样瓶中，待测定[12]。

1.2.6 浓硫酸法

准确吸取400 μg/mL脂肪酸标准溶液5.0 mL于15 mL具塞试管中，加入0.5 mL甲醇，在涡旋振荡仪上振摇2 min以充分混匀，再加入50 μL浓硫酸置于80 ℃恒温水浴箱中反应1 h。取出冷却至室温后，加入5 mL正己烷充分混匀，静置分层，移取上层的正己烷层，加入5 mL的超纯水与正己烷层充分混匀，最后分取出正己烷层，用氮气吹至近干，用正己烷定容至2 mL，过0.22 μm有机滤膜，转入进样瓶中，待测定。

1.2.7 酸碱法

准确吸取400 μg/mL脂肪酸标准溶液5.0 mL于150 mL锥形瓶中，加入2%氢氧化钠-甲醇溶液5 mL摇匀，安装冷凝回流装置，置于75 ℃恒温水浴箱中回流20 min。再移取0.5 mol/L硫酸-甲醇溶液10 mL从冷凝管上端加入，75 ℃水浴回流15 min，最后加入10 mL正己烷回流2 min。取出后冷却至室温，加入10 mL超纯水，在涡旋振荡仪上振摇5 min，静置分层后取上清液过0.22 μm有机滤膜，转入进样瓶中，待测定[13]。

1.2.8 三氟化硼-甲醇法

参照GB 5009.168—2016中的三氟化硼-甲酯化方法。准确吸取400 μg/mL脂肪酸标准溶液5.0 mL于150 mL锥形瓶中，加入2%氢氧化钠-甲醇溶液5 mL摇匀，装置冷凝回流管，置于75 ℃恒温水浴箱中回流20 min，再移取15%三氟化硼-甲醇溶液10 mL从冷凝管上端加入，75 ℃水浴回流5 min。取出后冷却至室温，加入10 mL超纯水，在涡旋振荡仪上振摇5 min，静置分层后取上清液过0.22 μm有机滤膜，转入进样瓶中，待测定。

1.2.9 GC-MS分析

色谱柱：HP-FFAP(50 m ×0.200 mm，0.25 μm)；升温程序：初始温度100 ℃，保持2 min，以6.0 ℃/min升至220 ℃，保持10 min；载气(He)流速1.0 mL/min，进样口温度270 ℃；分流比10∶1；样液进样量1.0 μL；传输线温度230 ℃；离子源温度220 ℃；电子轰击(EI)离子源；电子能量70 eV；选择性离子扫描模式(SIM)。

1.3 数据处理

利用Trace DSQ气质联用仪工作站中的C-Xcalibur和Excel 2007对数据进行处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 脂肪酸甲酯化色谱图

图1 6种甲酯化方法的色谱图Fig.1 Chromatograms of six methylation methods

由图1可知，采用4 mol/L氢氧化钠-甲醇法测定脂肪酸，图谱上无法看出峰形；采用0.4 mol/L氢氧化钠-甲醇法测定两种脂肪酸，虽然出现两种脂肪酸甲酯化后的峰，但两者峰形与峰面积差异较大，且分离度和峰形较差，无法准确检测4-乙基辛酸和4-甲基辛酸；以1%硫酸-甲醇法测定得两者的峰形及峰面积不明显，仅能检测到少量4-甲基辛酸和4-乙基辛酸；浓硫酸法与1%硫酸-甲醇法类似；与这4种方法相比，酸碱法和三氟化硼-甲醇法所测得的色谱图峰形和分离度较好，且4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的相对百分含量比值均接近1∶1，可作为定量测定这两种脂肪酸的甲酯化方法。

6种甲酯化方法中，4 mol/L氢氧化钠-甲醇法和0.4 mol/L氢氧化钠-甲醇法所得的色谱峰不理想，说明4-甲基辛酸和4-乙基辛酸在碱性条件下甲酯化效率较低，在室温条件下反应条件温和，并伴随有产物的水解反应，因此不能有效生成或只生成极少量的脂肪酸甲酯。1%硫酸-甲醇法中，浓硫酸与脂肪酸直接反应，由于反应较强烈，使脂肪酸脱水，因此脂肪酸测定结果中脂肪酸甲酯的含量较低。同样，在浓硫酸法中，脂肪酸在酸性条件下与甲醇发生酯化反应，可能存在硫酸使甲醇脱水生成甲醚的副反应，使反应不完全[14]。而酸碱法和三氟化硼-甲醇法所测结果相近，测得峰形较好，是因为在冷凝回流的过程中脂肪酸与溶液接触的机会增多，充分反应形成甲酯[15]。

检索Nist 08谱图库，确定两种脂肪酸甲酯的出峰时间及种类，见表1。

表1 2种脂肪酸甲酯保留时间Table 1 Retention time of two fatty acid methyl esters

2.2 方法线性、检出限和定量限

配制系列浓度的混合标准溶液(0.10，0.20，0.50，1.0，5.0 μg/mL)，分别采用酸碱法和三氟化硼-甲醇法对标准溶液进行甲酯化处理，由高浓度至低浓度依次进样检测，以质量浓度与峰面积做标准曲线线性回归。以添加回收浓度为依据，以特征离子质量色谱峰性噪比S/N=3计算检出限，S/N=10计算方法定量限。结果表明，两种方法处理后的脂肪酸甲酯在0.10～5.0 μg/mL范围内呈现良好的线性关系，见图2。酸碱法的检出限均为0.017 μg/kg，定量限为0.057，0.056 μg/kg，三氟化硼-甲醇法的检出限均为0.010 μg/kg，定量限为0.032，0.033 μg/kg，结果见表2。

图2 两种方法的线性关系图Fig.2 Linear relationship diagrams of the two methods

2.3 方法的回收率和精密度

分别称取0.001 g的 4-甲基辛酸和4-乙基辛酸标准品，用正己烷定容至100 mL，准确移取25 mL标准品溶液至容量瓶中，用正己烷定容至50 mL，相当于各含4-甲基辛酸和4-乙基辛酸5 mg/L。平行称取同一种羊的脂肪样品(白山羊)6份，其中3份样品加入脂肪酸标准液，另外3份做实际样品检测，分别用酸碱法和三氟化硼-甲醇法对样液进行甲酯化处理，考察方法的加标回收率与精密度。结果表明，酸碱法的平均加标回收率为47.49%和42.04%，相对标准偏差(RSD，n=6)为11.26%和10.77%；三氟化硼-甲醇法的平均加标回收率为20.18%和18.19%，相对标准偏差为6.44%和6.35%，见表2。由于4-甲基辛酸和4-乙基辛酸属于挥发性化合物，如羊奶常采用闪蒸脱膻的方法去除膻味，因此在甲酯化过程中可能造成膻味脂肪酸的差异[16]。

表2 方法相关系数、检出限、定量限与回收率Table 2 Correlation coefficients, detection limits, quantitative limits and recovery rates of the methods

2.4 羊脂肪的测定

准确称取4种羊的浓缩脂肪各50 mg，置于150 mL三角瓶中，按照上述方法中的酸碱法和三氟化硼-甲醇法对羊脂肪进行处理并测定。羊脂肪色谱图见图3和图4。

图3 酸碱法测定羊脂肪色谱图Fig.3 Chromatograms of determination of fatin sheep by acid-base method

由表3可知，酸碱法的甲酯化效率总体上高于三氟化硼-甲酯法。4个品种羊中，黑山羊的4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的甲酯化含量都明显高于其他3种羊。该结果与羊肉的膻味程度相一致，这可能与羊的基因、饲养方式等密切相关。

图4 三氟化硼-甲醇法测定羊脂肪色谱图Fig.4 Chromatograms of determination of fat in sheep by boron trifluoride-methanol method

表3 4个品种羊膻味脂肪酸含量Table 3 The odor fatty acid content of four varieties of sheep

3 讨论

丁艳艳等通过在绵羊脂肪样品中加入不同量脂肪酸标品对4-甲基辛酸和4-甲基壬酸的回收率进行了考察，发现当2-乙基壬酸添加量达到2 mL时，4-甲基辛酸和4-甲基壬酸的回收率达到最大，为19.80%和19.86%，2-乙基壬酸的最大回收率则为24%。而在本试验中，经过酸碱法甲酯化后的4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的回收率则达到了47.49%和42.04%，且不需要添加内标，反应时间较短，适用于羊肉中膻味物质的研究。

挥发性脂肪酸对羊肉的膻味起着重要作用，尤其是4-甲基辛酸和4-乙基辛酸对羊肉的这种特殊风味起着主要骨架作用[17]。而不同品种的羊肉中，所含的4-甲基辛酸和4乙基辛酸也有所不同。研究发现，营养和遗传两大因素对羊肉的肉质及风味有很大影响，饲养方式、饲料种类及品种等都会对羊肉所含的脂肪酸造成影响[18]。引起膻味的支链脂肪酸更是与羊的品种、年龄、性别和部位等相关[19]。老龄羊肉的膻味通常比幼龄羊肉重，而公羊肉相比母羊肉有较强的膻味[20]。Young等[21]的研究表明，饲养方式会对羊肉膻味造成不同程度的影响，将一批羊进行放牧饲养，经检测发现该放牧饲养下的羊肉中4-甲基辛酸和4-甲基壬酸等膻味脂肪酸含量比其他饲养方式的高。因贵州地势为喀斯特地貌，草山草坡较多，贵州黑山羊主要以放牧饲养为主[22]，这也可能是造成黑山羊肉膻味脂肪酸含量较高、膻味较重的原因之一。白山羊和黔北麻羊通常通过补饲等提高其生长性能，晴隆绵羊则通过引进和选育而逐渐成为贵州羊中的优良品种。从品质上，贵州黑山羊具有适应能力强、抗病能力强、耐粗饲等特点，但由于长期的自然放牧，黑山羊的膻味物质含量较其他品种高。因此从感官上来说，白山羊、黔北麻羊和晴隆绵羊可能更容易被消费者所接受。

4 结论

本文对4-甲基辛酸和4-乙基辛酸这两种膻味脂肪酸的甲酯化方法进行了研究，从6种甲酯化方法中筛选出酸碱法和三氟化硼-甲醇法。将这两种方法用于实际样品检测中，对贵州几个具有代表性的品种即白山羊、黑山羊、黔北麻羊和晴隆绵羊的脂肪组织进行测定发现，黑山羊脂肪组织中的4-甲基辛酸和4-乙基辛酸明显高于其他品种羊，白山羊和黔北麻羊其次，晴隆绵羊最低，因此4个品种羊肉的膻味程度各不相同。