桃红四物汤对CCl4诱导肝纤维化小鼠治疗作用及其机制研究

邱 勇

三峡大学中医医院(宜昌市中医医院)(宜昌 443000)

肝纤维化是由各种致病因素引起肝细胞损伤，导致肝内结缔组织异常增生并相对可逆的病理改变过程，是各种慢性肝病进展为肝硬化的前期阶段[1-2]。因此，在该阶段进行干预治疗，对肝硬化的防治具有重要意义[3]。中医药在对肝纤维化的治疗中有明显的优势，主要以活血化瘀为主。其中，桃红四物汤在临床上广泛应用于肝纤维化患者，具有良好的疗效[4-5]。在此基础上，本实验从动物水平探讨桃红四物汤对肝纤维化的影响及可能存在的作用机制。

材料和方法

1 实验动物 健康昆明小鼠50只，雌雄各半，体重18 ～ 22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号为SCXK(京)2012-0001。

2 实验药物 桃红四物汤由熟地12 g，白芍、当归、桃仁各9 g，川芎、红花各6 g组成，实验药材均购于老百姓大药房。按上述比例进行称量药物，并按传统方法将中药浸泡，武火煮沸，文火煎2次，去渣并合并浓缩至1 g/ml浸膏备用。秋水仙碱片(国药准字H53021369，规格：0.5 mg/片)。

3 实验试剂 CCl4(无锡市展望化工试剂有限公司，批号450105)；ALT、AST、SOD、MDA、GSH-PX试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ试剂盒均购于上海研晶生物科技有限公司；BCA蛋白质定量试剂盒购于博士德生物工程有限公司。

4 实验仪器 电子天平(德国Sartorius)，T18匀浆机(德国IKA集团)，低速台式离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)。

5 动物分组及给药方法 随机取10只小鼠为正常对照组，余40只小鼠按参考相关文献[6- 7]，采用30%CCl4花生油溶液按1 μl/g腹腔注射进行造模，2次/周，共8周，正常对照组腹腔注射等剂量的花生油。造模完成后再随机分为模型组、秋水仙碱组(1 mg/kg)、桃红四物汤低、高剂量组(4.25 g/kg，17 g/kg)，每组10只。造模后各组按剂量灌胃给药，1 d1次，连续给药6周，正常对照组及模型组予以等容量蒸馏水灌胃。末次给药后予以禁食不禁水，24 h后予以3%水合氯醛麻醉后心脏采血，并取出肝脏备用。

6 检测指标

6.1 血清指标检测:小鼠麻醉后用普通抗凝管心脏采血，后以3000 r/min离心5 min，取上清，按试剂盒说明检测小鼠ALT、AST；取左叶肝脏加生理盐水制作10%肝组织匀浆液，2500 r/min离心10 min，取上清，按试剂说明进行检测HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、SOD、MDA、GSH-PX。

6.2 病理组织学检测:用4%多聚甲醛固定小鼠肝右叶组织，常规石蜡包埋，切片，HE染色，脱水，封片后光镜下观察肝脏组织学改变。

结 果

1 桃红四物汤对各组小鼠血清ALT、AST活性的影响 结果如表1所示，CCl4造模后，ALT、AST活性显著升高(P<0.01)。治疗后，秋水仙碱组及桃红四物汤低、高剂量组的ALT、AST活性均显著降低(P<0.01)。

表1 桃红四物汤对各组小鼠血清ALT、AST的影响(U/L)

注：与正常对照组相比，△P<0.01；与模型组相比，◇P<0.01

2 桃红四物汤对小鼠血清肝纤维化指标的影响 结果表明，正常组与模型组相比，模型组HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量明显升高(P<0.01)；与模型组相比，秋水仙碱组及桃红四物汤高剂量组HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量明显降低(P<0.05)；桃红四物汤低剂量组中HA、PC-Ⅲ的含量改变不明显(P>0.05)，LN、C-Ⅳ含量明显降低(P<0.05)。见表2。

3 桃红四物汤对小鼠肝脏病理组织学的影响 常规肝组织HE染色可见，正常对照组肝小叶结构及肝细胞正常，无胶原纤维增生或炎症浸润。模型组可见肝小叶结构不清，部分肝细胞弥漫性水肿、坏死及脂肪变性，伴有炎性细胞浸润，汇管区可见大量纤维组织增生，假小叶形成。与模型组相比，秋水仙碱组及桃红四物汤低、高剂量组各组肝小叶结构破坏程度降低，肝细胞水肿、坏死、变性及炎症浸润也减少，纤维组织增生及假小叶也得到改善(图1)。

4 桃红四物汤对小鼠肝组织内SOD、MDA、GSH-PX含量的影响 由表3可知，CCl4造模后，模型组SOD、GSH-PX明显降低(P<0.01)，MDA明显升高(P<0.01)，经治疗后，秋水仙碱及桃红四物汤高剂量组SOD、GSH-PX含量均显著上升(P<0.01)，MDA显著下降(P<0.01)；桃红四物汤低剂量组SOD、MDA改变不明显(P>0.05)，但GSH-PX含量明显上升(P<0.01)。

表2 桃红四物汤对小鼠血清HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ的影响

注： 与正常对照组相比，△P<0.01；与模型组相比,◇P<0.01，▲P<0.05

A：正常对照组；B：模型组；C：秋水仙碱组；D：桃红四物汤低剂量组；E：桃红四物汤高剂量组

表3 桃红四物汤对小鼠肝组织内SOD、MDA、GSH-PX含量的影响

注：与正常对照组相比，△P<0.01；与模型组相比，◇P<0.01,▲P<0.05

讨 论

肝纤维化的病因很复杂，常见的主要有肝炎病毒、酒精、药物、毒物、血吸虫、免疫炎症等多种因素长期损伤引起，是进展为肝硬化及肝癌的必经之路[8]。肝纤维化的发生发展是一个复杂的全身性的病理生理过程，涉及多种细胞因子及信号通路，目前认为，肝脏受损后，肝内Kupffer细胞被激活，分泌细胞因子，这些因子可活化肝星状细胞(HSC)，使其转化为肌成纤维细胞，并与多种因子结合，分泌大量细胞外基质成分，由于细胞外基质成分不断产生、沉淀，遂身体发生了肝纤维化[9-10]。

中医学认为，肝纤维化多属于“胁痛”、“黄疸”、“癥瘕”、“痞满”、“积聚”等范畴，多由湿热毒邪内侵，导致肝气郁滞，脾虚不运，日久气虚血瘀，进而损伤肝肾之阴，最终导致正虚血瘀[11-12]。桃红四物汤是在四物汤的基础上加桃仁、红花而成，是活血养血之代表方。方中桃仁、红花、川芎、当归等单味药均表明有抗肝纤维化作用[13]，临床研究发现该方对肝纤维化等肝脏疾病也具有良好的治疗效果[4-5]。本研究表明，桃红四物汤可明显降低CCl4诱导肝纤维模型中ALT、AST的含量，减少HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ的释放，并能降低肝小叶结构破坏程度，减少肝细胞水肿、坏死、变性及炎症浸润，改善纤维组织增生及假小叶形成，具有明显的护肝作用。

SOD能有效地清除活性氧和自由基，是体内主要的抗氧化防御活性物质；GSH-PX为分解氢过氧化物所必须的物质，其含量多少是衡量机体抗氧化能力的重要因素；MDA 是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，可间接反映机体的自由基代谢变化及细胞的损伤程度。桃红四物汤可提高CCl4诱导小鼠肝纤维化肝组织匀浆中SOD、GSH-PX的活性，降低MDA的水平。提示桃红四物汤可以提高机体抗氧化能力，清除活性氧和自由基，抑制脂质过氧反应，从而发挥对肝脏的保护作用。

综上所述，桃红四物汤对CCl4诱导肝纤维化模型具有保护作用，其保护作用机制可能是通过提高肝脏抗氧化的能力，降低脂质过氧反应实现的。