针灸透刺鹤顶与内膝眼穴对兔膝关节炎软骨细胞免疫微环境调控的影响

张翠洲，刘 渊，张二尹，张严匀，张艺馨

广西中医药大学(南宁 530001)

膝骨性关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)病变部位主要涉及膝关节软骨、软骨下骨以及滑膜组织等[1]，是中老年人常见病和多发病，临床上主要表现为关节疼痛、关节变形、僵硬肿胀等为主，严重影响患者的生活质量，虽然目前中西医治疗各有优势，但很难彻底解决本病软骨细胞凋亡的病理改变[2]，近年来有学者进行多方面研究发现在退变的膝骨关节炎的关节液中，大量的免疫细胞及炎症因子参与病变过程，与病情的严重程度成正相关[3]，因此在研究软骨细胞凋亡和力学改变的基础上，更多学者将研究骨关节炎的目光投入到机体免疫炎症方面，对炎性因子与膝关节软骨代谢标志物水平的影响作了相关报道[4]。近年来，研究报道[5-6]针灸穴位治疗KOA具有较好的临床疗效，作为一种安全无副作用的治疗方法备受肯定。笔者在临床实践中运用针灸透刺鹤顶与内膝眼穴治疗KOA，取得较满意的临床疗效，但对其治疗机理尚不清楚，因此本课题研究是否通过透刺鹤顶与内膝眼穴调节膝关节免疫微环境而达到治疗目的进行了研究，从而为推广临床治疗提供理论依据。

材料和方法

1 材 料

1.1 动物：选取健康4～6月龄雌性新西兰白兔24只，体质量(2.05±0.1) kg，由广西中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(桂)2003-0001。饲养于广西中医药大学实验动物房，饲养温度18℃～22℃，湿度45%～55%，自由饮食。

1.2 药物与试剂：木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸，购于美国Sigma公司、0.9%的生理盐、1%戊巴比妥钠、兔IL-6、TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13试剂盒由美国San Diego公司提供，对物品的操作过程严格按照说明书进行。

1.3 主要仪器：酶标仪、Western blot检测仪、低温冰箱及便携式标本贮藏罐等，关节量尺、关节角度测量仪。

1.4 造模试剂的配置：2%木瓜蛋白酶和0.03mol/L L-半胱氨酸混合液配制，充分溶解和搅拌均匀，在无菌条件下用0.22μm滤膜过滤去除未溶解的杂质，静置30 min后待用[7]。

2 实验方法

2.1 造模方法：将24只新西兰兔随机分为A、B、C三组，A组不做任何处理，B、C组于造模前1 h配制2%的木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸混合液，于实验的第1、4、7天向兔子右膝关节内注入混合液0.5 ml。具体方法：将兔子固定于兔台上，刮除右膝关节部位兔毛，用75%乙醇消毒后在髌韧带附着点外上方约0.5 cm处进针注入造模剂混悬液。针头刺入关节腔内有落空感后回抽无血性液体，注入0.5 ml混合液，活动兔膝关节使混合液充分分布在关节内[8]。术后连用3天青霉素钠(国药准字H37021950)5万单位/(kg·d)，于造模1周后开始实验。

2.2 实验治疗：A组为正常对照组给予生理盐水灌胃，灌胃量为2 ml/100g；B组为造模组，生理盐水灌胃，灌胃量为2 ml/100g，两组均为1次/d灌胃，持续4周；C组给予针灸透刺鹤顶至内膝眼穴位1次/d，20 min/次，持续4周。所有动物单笼饲养，4周末分别处死所有动物。

3 指标测定 治疗结束后首先进行关节行为学检测，膝关节的疼痛、步态、关节活动度及关节肿胀指标，采用关节测量仪和关节尺检测并记录，其后抽取各组兔耳缘静脉血，离心后用ELISA检测血清IL-6表达水平；最后处死实验各组兔，取关节组织匀浆，提取蛋白，BCA法蛋白定量，调整蛋白浓度。Western blot分析目的蛋白TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13的表达水平。

4 统计学方法 统计分析采用SPSS 22.0统计学软件处理，各组之间比较用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 ELISA血清IL-6检测 血清结果显示C组检测指标IL-6与A组相比较略高，但两者比较无统计学差异(P>0.05)；而B组血清IL-6水平高于其它两组，三者比较有统计学差异(P<0.05)，见表1。

表1 三组血清IL-6水平(ng/L)

2 Western blot检测TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13表达情况 C组检测指标TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13与A组各对应指标比较无统计学差异(P>0.05)，而B组TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13各项指标均高于C组，两者各指标相互比较有统计学差异(P<0.05)。见表2。

表2 三组Western blot检测目的蛋白灰度值

3 行为学观察结果 在治疗结束后采用改良Lequesne MG评估方法对各组家兔膝关节的疼痛、步态、关节活动度及关节肿胀等行为学指标，进行计分评价，并计算结果总分差值进行统计学分析。结果B组4项各评分明显上升，与A和C组相比三组均有统计学差异(P<0.05)。见表3。

表3 三组行为学各项检查结果(分)

讨 论

膝骨性关节炎是一种临床上较为常见的膝关节退行性病理改变，发于老年人当中，轻症患者可见膝关节处明显疼痛，以及活动受限等临床表现，重症时可致患者发生慢性残疾[9]，严重影响患者的生命质量等特点[10]，目前针对本病治疗主要以减轻疼痛，缓解软骨退变等为主，随着研究的多样性和不断深入，除软骨退变外，机体免疫炎症对膝关节局部微环境产生的影响也正在被越来越多的学者关注[11]。研究发现，膝关节局部产生炎症介质是导致关节软骨退变和滑膜细胞活化的原因之一，与健康人对比，KOA患者的血清中某些炎症介质的水平明显升高[12]，而KOA关节液中的蛋白可导致巨噬细胞通过TLR4信号通路产生炎症因子[13]，同时关节组织中高度浸润的T淋巴细胞释放大量炎症因子，这些炎症因子可增强微环境的免疫反应而促使软骨基质进一步破坏，因此在研究膝骨关节炎的病理机制时，应不单从软骨蜕变研究，更要研究免疫微环境的改变对KOA的病变机制的影响。

在前期的研究中[14]，我们已经发现和证实膝骨关节炎的发生与细胞CTX-Ⅱ和COMP存在密切的关联性，多指标联合应用能大大提高膝骨关节炎的诊断准确性，在膝骨关节炎的发病中具有重要的作用，并且可以反映病情和证型的变化，这为本次研究提供了较坚实的实验依据。同时近年来的研究发现[15]，结合骨生物学与骨免疫学研究，可以更好地揭示免疫系统和骨关节系统的密切联系，深入研究免疫细胞在骨相关疾病的生理病理过程中发挥了重要作用是目前研究的一个趋势。据研究报道[16]，炎性病变与TLRs信号通路在膝骨关节炎的发挥着重要的作用，Toll样受体(TLRs)做为模式受体之一，当膝骨关节受到炎性损伤时，会激活TLRs信号通路，使TLR相关受体(TLR3、TLR4、TLR7)与髓样细胞分化因子(MyD88)结合，从而激活下游信号转录因子NF-κB，而这两者均属于固有免疫的模式识别受体(PRR)，从而产生天然免疫激活程序，调控IL-6、TNF-α、MMP-13等重要炎症因子，抑制炎症反应，这些研究为本次开展相关研究提供了理论和实验基础。

KOA属中医学“痹证”、“骨痹”范畴[17]，主要由老年人机体肝肾不足、气血亏虚，加之风邪寒湿入体等综合原因而引发本病，表现为本虚标实，不通则痛的病理机制。因此本病的治疗应以改善局部血供、调理经脉、开阻除痹、活血通络为主[18]。本病属于慢性迁延性疾病，中医治疗以中药内服外用、针灸推拿等为主，尤其擅长慢性劳损性疾病的治疗，治疗效果较好，并且安全性高，毒副作用小。其中针灸治疗本病疗效明确、操作便捷、创伤小且无毒副作用，为临床治疗膝骨关节炎常用方式。贺小卉[19]用不同针灸方式治疗虚寒型膝骨关节炎患者162例，观察骨性关节炎指数(WOMAC)评分及疼痛症状，观察组显效率是62.96%，总有效率是98.77%，均分别明显高于对照组的46.91%及90.12%，认为利用温针灸治疗KOA患者可产生较好的疗效。目前研究大多数学者从温通角度出发[20]，取得了满意的临床疗效，而在临床运用中，我们发现通过透刺针法治疗KOA，患者也能取得较满意的疗效，尤其是选取经外奇穴内膝穴和鹤顶穴时，疗效显著。内膝穴和鹤顶穴位于膝关节内上侧，均属经外奇穴，均主膝痛，足胫无力，鹤膝风等病症，尤其是对于早中期KOA的治疗有明显的效果，但缺少明确的治疗机制研究和报道。目前针灸治疗本病分为针刺、温针灸、火针、电针、浮针等，《素问·痹论》载：“风寒湿三气杂至，合而为痹也。其风气胜者为行痹，寒气胜者为痛痹，湿气胜者为着痹也” 。痹证是指风、寒、湿、热之邪侵袭人体经络，导致气血不通，经脉闭塞所引起的病证，临床表现多为关节疼痛，活动障碍，酸软无力，关节畸形等，目前研究表明[21]，针灸不仅能够提高免疫细胞如淋巴细胞、中性粒细胞、单核巨噬细胞、NK细胞等的数量、活性及功能，还能通过减少损伤性细胞因子，增加保护性细胞因子，免疫球蛋白及补体等增强机体的免疫功能，且能延缓免疫器官的萎缩和功能退化[22-25]。

因而本次课题研究从免疫学TLRs信号通路为切入点，建立兔膝关节炎模型，运用现代医学研究手段进行针灸透刺穴位治疗膝骨关节炎的动物研究。结果研究发现运用针灸透刺鹤顶至内膝穴，可以明显改善兔膝关节的的疼痛、步态、关节活动度及关节肿胀等行为学指标，与模型组比较差异具有统计学意义，这表明透刺穴位有利于膝关节经络的疏通，起到疏经通络并调和气血的治疗效果。进一步抽取血清学和关节软组织提取检查，发现血清IL-6在C组较B组明显降低，两者比较差异具有统计学意义，与此同时关节组织的免疫学TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13检测也同血清学检测相一致。这充分说明运用透刺鹤顶至内膝穴可以从内改善关节免疫炎症，同时改善关节的各项力学指标，还可利于膝关节血管的扩张，并加速血液循环，缓解或消除因关节损伤而导致的炎症，最终发挥了消肿止痛和散寒通络之功效。

此次研究证实了临床运用此透刺手法治疗膝骨关节炎确实有效，并且通过研究表明，膝骨关节炎不仅是软骨退变性疾病，其免疫学的改变和参与也应当得到重视。同时为临床运用此法治疗KOA和后期进一步利用细胞分子、生化等检测技术更深一层探讨具体信号通路及效应的作用机制奠定基础。