肺癌组织中Livin、信号转导转录活化因子3基因的表达观察

王晓月，葛爱，林勇

(1南京市胸科医院，南京 210029;2上海市肺科医院)

肺癌发生于支气管黏膜上皮，在临床上也称之为支气管肺癌，随着工业发展的不断进步，肺癌的发病率和病死率也逐年攀升[1]。在我国的绝大部分地区，肺癌的病死率居恶性肿瘤首位[2]。目前肺癌的治疗主要以手术治疗、放化疗、免疫治疗和中医治疗为主，治疗方式的进步极大改善了肺癌患者的预后和生存[3]，但仍有部分患者疗效不佳。肺癌的发生发展过程中涉及到一系列基因和蛋白的变化，寻找到与肺癌密切相关的肿瘤标志物，也许可以将其用于肺癌患者的靶向治疗[4]。

Livin属于凋亡蛋白抑制因子家族成员，能够抑制细胞凋亡，其在正常组织中低表达，而在乳腺癌、肠癌和胃癌等肿瘤组织中高表达[5]。研究[6]报道显示，Livin与黑色素瘤、胃癌和乳腺癌等肿瘤的转移和分化相关。信号转导转录活化因子3(STAT3)是一种DNA结合蛋白，能够被Jauns激酶(JAK)磷酸化激活，激活后的STAT3进入细胞核并结合到基因的启动子上调控该基因的转录[7]。肿瘤转移和分化过程中多种癌基因被激活，可见STAT3转录激活癌基因与肿瘤转移和分化密切相关。研究[8]报道显示，在乳腺癌和胃癌中STAT3能够调控Livin基因转录，进而促进肿瘤细胞转移。目前，STAT3和Livin在肺癌中的表达情况及二者之间的关系仍不清楚，需要进一步研究证实。为此，本研究观察了86例肺癌患者癌组织中Livin和STAT3基因的表达变化，并探讨了二者与肺癌患者临床病理特征之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2016年8月～2018年10月南京市胸科医院收治的肺癌患者86例，男45例、女41例，年龄42～75(56.36±10.74)岁，肺腺癌52例、鳞癌34例，有吸烟史21例、无吸烟史65例，TNM分期[9]Ⅰ期32例、Ⅱ期22例、Ⅲ期18例、Ⅳ期14例，分化程度为低分化57例、中分化17例、高分化12例，淋巴结转移25例、未发现淋巴结转移61例，肺癌组织直径在5 cm以下53例、5 cm以上33例。纳入标准：①经病理学诊断确诊为肺癌者；②与院方签署知情同意书者；③临床资料完整，并且随访资料完善者；④患者在入院之前未接受过放化疗治疗。排除标准：①肝肾功能异常者；②确诊为肺癌，但是合并有其他类型肿瘤者；③患者为孕妇或者处于哺乳期；④存在精神障碍，对治疗的依从性较差者。

1.2 肺癌及癌旁组织中Livin mRNA、STAT3 mRNA检测 手术切除肺癌组织以及距离肺癌组织3 cm以上的癌旁组织后将其置于冻存管中，液氮速冻之后置于-80 ℃冰箱保存。待需要检测时，将组织从-80 ℃冰箱取出并置于液氮速冻，使用研钵将肿瘤组织研磨成粉末，根据肿瘤组织的大小加入适量的TRIzol提取液，使用移液枪充分吹打混匀，冰上裂解30 min后加入苯酚-氯仿-异戊醇抽提液抽提肿瘤组织中的RNA，抽提结束后用乙醇将RNA沉淀，3 000 g离心10 min后弃去上清液，待乙醇蒸发完全后加入无菌水进行溶解，获得RNA溶液。随后使用逆转录试剂盒(美国赛默飞世尔生物科技有限公司)将RNA逆转录为cDNA，实验操作严格按照试剂盒说明书进行。获得cDNA文库后使用荧光定量PCR仪(美国安捷伦科技有限公司，型号Mx3000PS)、实时荧光定量PCR试剂盒(美国赛默飞世尔生物科技有限公司)对Livin和STAT3的表达进行检测，操作方法严格按照试剂盒说明书和仪器说明书进行。Livin的PCR引物序列：正向引物：5′-TGGTCCGGCGCATGGCTGCT-3′，反向引物：5′-TTGGGTGCCAGCAAGAAGG-3′。STAT3的PCR引物序列：正向引物：5′-AGCTCAAGGGGCCGCATCG-3′，反向引物：5′-TCGAGGGCACCTTCCTGAT-3′。GAPDH的PCR引物序列：正向引物：5′-TCTCTCAGATGTAACTGAGCTG-3′，反向引物：5′-TAGCTCATCAACCGATCT-3′。在检测Livin和STAT3表达量的同时，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，并检测其表达量。反应体系共 20 μL，13 μL SYBR Green Premix，上游和下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O离子水3 μL。反应条件：96 ℃ 预变性5 min，95 ℃ 变性40 s，60 ℃ 退火60 s，70 ℃延伸30 s，共40个循环。通过相对ΔCt值法对Livin和STAT3相对表达量进行计算，目的基因Livin和STAT3的相对表达量以2-ΔΔCt表示，其中ΔCt目的基因=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt目的基因=ΔCt目的基因-Ct阴性对照。

2 结果

2.1 肺癌及其癌旁组织中Livin mRNA、STAT3 mRNA相对表达量比较 肺癌组织中Livin mRNA、STAT3 mRNA相对表达量分别为10.24±2.35、8.23±2.27，癌旁组织Livin mRNA、STAT3 mRNA的相对表达量分别为2.39±0.41、1.08±0.23，两组比较，t分别为30.517、29.061，P均<0.01。

2.2 肺癌组织中Livin mRNA、STAT3 mRNA表达与患者临床病理特征之间的关系 肺癌组织中Livin mRNA、STAT3 mRNA表达与患者肿瘤组织的分化程度、淋巴结转移和肿瘤分期相关(P均<0.05)，与患者的年龄、性别、吸烟史、肺癌的病理分型和肿瘤体积大小无关(P均>0.05)。见表1。

表1 肺癌组织Livin mRNA、STAT3 mRNA表达 与患者临床病理参数的关系

2.3 肺癌组织中Livin mRNA、STAT3 mRNA表达的相关性 肺癌组织中Livin mRNA与STAT3 mRNA表达呈正相关(r=0.607，P=0.011)。

3 讨论

肺癌的发病与遗传和环境因素密切相关。研究[10]报道显示，携带肺癌易感基因的人群肺癌发生率明显高于正常人群，而吸烟和尘肺也是肺癌发生的影响因素。肺癌的早期症状不明显，临床上容易产生误诊和漏诊，大部分患者在确诊肺癌时已经处于肺癌晚期[11]。肺癌发病是多基因综合作用的结果，涉及到的基因数量庞大，并且肺癌的发病过程分为多个阶段，各个阶段发挥作用的基因类群迥异，因此肺癌的发病分子机制极为复杂。目前对肺癌发病的分子机制仍然缺乏了解，已有的肿瘤干细胞假说、化学致癌假说、肺细胞DNA损伤致癌假说、肺癌物理因子致癌假说和肿瘤免疫逃逸假说均只能部分解释肺癌的发病过程，因此迫切需要对肺癌发病的分子机制进行深入研究，从中寻找可以用于肺癌早期诊断和治疗的分子标志。

Livin蛋白是一种抗凋亡蛋白，主要分布于细胞质中。内质网-高尔基体对Livin蛋白进行糖基化修饰，研究报道显示，Livin蛋白的糖基化修饰对于Livin蛋白的抗凋亡作用十分重要。在乳腺癌、卵巢癌和胃癌中均能够观察到Livin的高表达，在多种肿瘤中Livin主要作为癌基因发挥作用[11]。Livin蛋白通过抑制Caspase途径和激活JNK来抑制肿瘤细胞的凋亡[10]。研究[12]报道显示，Livin能够激活细胞内的生存素信号通路，进而调节乳腺癌细胞和胃癌细胞的分化和转移。STAT3蛋白是JAK-STAT3信号通路中的关键蛋白分子，STAT3在未被激活的情况下主要位于细胞质中，并以单体的形式存在。经JAK磷酸化修饰后，两个STAT3单体相互作用并形成相应二聚体，通过蛋白结构上的核定位信号进入细胞核中发挥转录调节功能。研究[13]显示，STAT3作为转录因子能够激活一系列癌基因的转录，进而调节肿瘤细胞的增殖和转移。本研究结果显示，肺癌患者癌组织中Livin、STAT3表达均高于对应的癌旁组织，表明在肺癌发生发展过程中可能有Livin和STAT3的参与。研究报道显示，STAT3的表达上调与肺癌细胞膜上的JAK受体蛋白的活化密切相关，JAK受体蛋白的活化会导致下游一系列蛋白的磷酸化活化，进而激活STAT3[14]。肺癌中Livin表达上调的机制仍不明确，已有研究[15]报道显示，Livin表达上调与死亡受体信号通路的激活相关。

研究[16]表明，Livin能够与细胞命运决定因子等肺癌分化相关蛋白相互作用，进而调节肺癌的分化和转移。STAT3的表达上调能够激活有丝分裂原激活的蛋白激酶信号通路，进而调控肿瘤细胞的上皮-间质转化，从而促进肿瘤转移[17]。本研究发现，肺癌组织中Livin和STAT3表达与肿瘤组织的分化程度、淋巴结转移和肿瘤分期相关。表明Livin和STAT3表达参与肺癌的增殖及转移等恶性生物学过程。本研究还发现，肺癌组织中Livin和STAT3的表达呈正相关。可能是因为当STAT3被JAK磷酸化激活后进入细胞核，进入细胞核内的STAT3能够结合一系列基因的启动子、并激活癌基因的转录，而Livin基因在多种肿瘤中均显示是一种癌基因，因此STAT3能够结合到Livin基因的启动子区域并激活其转录，导致Livin表达水平升高[18]。但是对STAT3调节Livin表达的分子机制仍然需要更进一步实验进行验证。

综上所述，肺癌组织中Livin和STAT3 mRNA表达上调，与肿瘤组织的分化程度、淋巴结转移和肿瘤分期密切相关，二者可能可以作为肺癌诊断、治疗效果和预后评估的分子标志，具体能否应用于临床需要进一步研究明确。