靶向Rac1的siRNA对口腔鳞状细胞癌HSC-3细胞的影响

王海业 麻颖宜

Rho家族又称Rho GRP酶，是一类GTP结合蛋白，具有GTP酶活性，在细胞增殖、分化、凋亡、运动转移和和血管生成等多种过程中发挥着关键作用［1］。Ras相关C3肉毒素底物1（Rac1）是Rho家族成员，被证实在胃癌［2］、皮肤癌［3］和卵巢癌［4］等多种肿瘤中异常高表达，可通过调控细胞增殖、转移和凋亡等在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。近年有研究指出，Rac1在口腔鳞状细胞癌中高表达，但其在口腔癌进展中的具体作用尚不明确［5］。口腔鳞状细胞癌是口腔癌中最为常见的病理类型，约占口腔癌的90%以上［6］。本研究以人口腔鳞状细胞癌HSC-3细胞为研究对象，采用小干扰RNA（siRNA）技术靶向抑制细胞中Rac1的表达，观察Rac1对HSC-3细胞增殖、侵袭和凋亡的影响，并探讨其可能的分子机制，以期为口腔癌的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1细胞、试剂与仪器 HSC-3细胞株购于美国ATCC，RPMI-1640培养基购于美国Gibco公司；胎牛血清购于美国Hyclone公司，胰蛋白酶购于中国碧云天公司，青霉素、链霉素购于上海先锋药业公司，Rac1抗体购于美国Proteintech公司，PVDF膜购于美国Millipore公司，脱脂奶粉购于瑞士Nestle公司，siRNARac1及其阴性对照siRNA-NC购于上海吉玛制药公司，β-catenin、c-Myc、Bcl-2、Cleaved Caspase-3和GAPDH等抗体均购于美国Santa Cruz公司，HRP-羊抗兔二抗购于美国Zymed公司，脂质体2000和RNA提取试剂盒购于美国Invitrogen公司。RIPA裂解液、CCK-8、超敏ECL发光和BCA蛋白浓度测定等试剂盒均购于上海Beyotime公司，细胞凋亡检测试剂盒购于中国万类生物公司，RT-PCR试剂盒购于上海Transgene公司；Transwell小室购于美国Costar公司，ELX800酶标仪购于美国Biotek公司，WD-9413B凝胶成像系统购于北京六一仪器厂，NaoDrop 2000紫外分光光度计购于美国Thermo公司，9700PCR仪购于美国ABI公司，PY-16电热恒温培养箱购于美国Crystal公司。

1.2实验方法

1.2.1HSC-3细胞培养、分组与转染 在37℃和5%CO2的常规培养条件下以含10%胎牛血清、100 μg／ml链霉素和100 U／ml青霉素的RPMI-1640培养基培养HSC-3细胞。接种适量的对数生长期HSC-3细胞于6孔细胞板上，常规条件下培养过夜。

实验分为未转染组（未做任何处理）、siNC组（转染siRNA-NC）和siRac1组（转染siRNA-Rac1）。观察细胞密度达70%以上时，参照脂质体2000说明书步骤将200 pmol的siRNA-NC和siRNA-Rac1转至siNC组和siRac1组细胞中。孵育4 h后，弃培养液，加入新鲜培养液继续培养24 h。

1.2.2HSC-3细胞中Rac1 mRNA表达的检测 采用RT-PCR检测。参照RNA试剂盒说明书步骤提取HSC-3细胞的总RNA。再根据RT-PCR试剂盒说明书将定量后的RNA进行逆转录。以逆转录产物为模板进行PCR扩增，2-ΔΔCT法计算HSC-3细胞中Rac1 mRNA的表达。反应体系：模板 1μl、上下游引物（10μM）各0.5μl、SYBR GREEN MasterMix 10μl，加入 dd H2O补至20μl。反应条件：95℃ 36 0s，95℃30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共40个循环。其中，由上海吉玛公司合成的引物序列如下：GAPDH引物F：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′和 R：5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′；Rac1引 物 F：5′-CGAGAAACTGAAGGAGAAGAAGC-3′和 R：5′-AAGGGACAGGACCAAGAACGAG-3′。

1.2.3HSC-3细胞增殖的检测 采用CCK-8法检测。以胰蛋白酶消化收集各组细胞，细胞计数后以每孔4×104个接种至3张96孔细胞板上。每组设置5个复孔。置于培养箱中分别培养24、48和72 h后，弃培养液加入10μl CCK-8试剂孵育4 h。以酶标仪在490 nm波长处检测各组细胞吸光度（OD）值。实验重复3次。

1.2.4HSC-3细胞侵袭的检测 采用Transwell小室检测。将无血清培养基稀释的Matrigel胶缓慢铺到Transwell小室膜上，置于培养箱中静止2 h。胰蛋白酶消化收集各组细胞，加入无血清培养基制备浓度为3×104个／ml的单细胞悬液。将Tanswell小室放入24孔细胞板中，在下室加入含胎牛血清的培养基800 μl，上室内加入细胞悬液200μl，每组设置3个重复。置于培养箱中常规培养24 h后，取出Transwell小室，经磷酸缓冲液洗涤后，小心除去上室中残留的细胞，分别以4%多聚甲醛和0.5%结晶紫对细胞进行固定和染色。磷酸缓冲液冲洗晾干后，放于倒置显微镜下观察穿膜细胞数，结果以随机选取的5个视野的均值表示。实验重复3次。

1.2.5HSC-3细胞凋亡的检测 采用流式细胞仪检测。收集转染24 h后的各细胞，加入磷酸缓冲液洗涤细胞后，加入500μl Binding Buffer重悬细胞。再分别加入Annexin V和PI各5μl避光下室温孵育15 min后，上机检测。重复检测3次。

1.2.6HSC-3细胞中 Rac1、β-catenin、Cleaved caspase-3、Bcl-2和c-Myc蛋白表达的检测 采用Western blot检测。收集转染后的各组HSC-3细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，并根据BCA蛋白浓度测定试剂盒检测总蛋白的浓度。将蛋白样品与上样缓冲液以1∶1比例混合并置于沸水中煮沸3～5 min。以每孔20μl上样液上样至SDS-PAGE凝胶孔中，80 V电压电泳2 h。湿转法转印到PVDF膜上。取出PVDF膜，浸入到TBST液中（含5%脱脂奶粉）封闭2 h。将膜与封闭液稀释的一抗工作液（1∶1000）放入杂交袋中，封口4℃下孵育24 h。将膜取出并以封闭液洗涤5 min×3次后，将膜与封闭液稀释的二抗工作液（1∶2000）放入杂交袋中，封口常温孵育1h。再次洗膜后，滴加ECL发光剂反应3 min。采用凝胶图像处理系统以GAPDH为内参，分析目的条带的光密度值。

1.3统计学方法 采用SPSS 22.0统计分析；实验数据以（±s）形式表示，三组组间数据采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD检验，两组组间采用独立样本t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Rac1 mRNA和蛋白的表达 转染siRNA-Rac1后HSC-3细胞中Rac1表达下降；siNC组中Rac1 mRNA和蛋白的表达水平与未转染组相比无显著性差异（P＞0.05），但siRac1组中Rac1 mRNA和蛋白的表达水平较未转染组明显降低（P＜0.01）。见图1和表1。

图1 Western blot检测HSC-3细胞中Rac1蛋白的表达

2.2Rac1对HSC-3细胞增殖的影响 下调Rac1表达可抑制HSC-3细胞增殖。未转染组和siNC组比较，HSC-3细胞在24、48和72 h增殖过程中的OD值无明显差异（P＞0.05）；但siRac1组细胞在24、48和72 h生长增殖过程中的OD值较未转染组均明显降低（P＜0.01）。见表2。

2.3Rac1对HSC-3细胞侵袭的影响 下调Rac1表达可抑制HSC-3细胞侵袭。三组侵袭细胞数分别为76.48±9.55、72.86±11.05和32.22±3.36。单因素方差分析三组间侵袭细胞数差异显著（F＝24.201，P＝0.001）；与未转染组比较，siRac1组中侵袭细胞数明显减少（P＜0.05）；而siNC组与未转染组间无显著差异（P＞0.05）。

表1 各组HSC-3细胞中Rac1 mRNA和蛋白的相对表达量±s

表1 各组HSC-3细胞中Rac1 mRNA和蛋白的相对表达量±s

*与未转染组比较，P＜0.01

组别 RNA 蛋白未转染组1.03±0.08 0.45±0.03 siNC组 0.97±0.06 0.48±0.03 siRac1组 0.31±0.02* 0.12±0.02*F 138.115 163.227 P 0.000 0.000

表2 各组不同时点HSC-3细胞的吸光度值比较/±s

表2 各组不同时点HSC-3细胞的吸光度值比较/±s

*与未转染组比较，P＜0.01

组别24 h 48 h 72 h未转染组0.52±0.04 0.85±0.06 1.21±0.11 siNC组 0.49±0.03 0.83±0.05 1.18±0.08 siRac1组 0.38±0.03*0.48±0.04*0.69±0.05*F 14.382 50.610 36.529 P 0.005 0.000 0.000

2.4Rac1对HSC-3细胞凋亡的影响 下调Rac1表达可诱导HSC-3细胞凋亡。各组的细胞凋亡率分别为（3.06±0.25）%、（3.18±0.32）%和（13.82±1.24）%，三组间存在显著差异（F＝201.764，P＝0.000）；与未转染组比较，siNC组细胞凋亡率无显著改变（P＞0.05），但siRac1组细胞的凋亡率明显升高（P＜0.05）。见图2。

图2 AnnexinV-fitc流式细胞检测HSC-3细胞的凋亡

2.5Rac1对Wnt／β-catenin信号通路的影响 下调Rac1表达可抑制Wnt／β-catenin信号通路的激活。siNC组Wnt／β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、c-Myc，以及其下游凋亡调控蛋白 Bcl-2和Cleaved Caspase-3的表达水平与未转染组比较无明显差异（P＞0.05），但 siRac1组β-catenin、c-Myc和Bcl-2T蛋白的表达水平均明显低于未转染组，而Bcl-2蛋白的表达水平明显高于未转染组（均P＜0.01）。见图3和表3。

图3 Western blot检测 Wnt／β-catenin信号通路相关蛋白的表达

3 讨论

Rac1基因位于人类7p22染色体上，全长29kb；通过与GTP结合激活或与GDP结合失活的循环作用在调控细胞生物学功能如细胞运动、增殖和凋亡等中发挥着重要作用，其异常表达与包括肿瘤在内的多种疾病的发生发展关系密切［7］。研究者分别对胃癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌的研究［8～11］发现，Rac1在癌组织中高表达，且其表达水平与肿瘤分化、浸润、增殖、侵袭、转移和预后等有关，抑制其表达有望成为延缓和治疗肿瘤发生发展的重要策略。

口腔癌是一种位居全球第六位的恶性肿瘤，近年来其发病率呈升高趋势，且发病年龄趋于年轻化，严重威胁着人们的身体健康［12］。目前口腔癌发生发展的机制并不完全清楚，探讨其发生发展的机制，寻找有效的分子靶点对口腔癌治疗具有重要意义。张月等［5］指出，Rac1在口腔鳞状细胞癌组织中表达水平显著高于癌旁组织，且其表达水平与肿瘤有无转移有关，与上皮间质转化相关蛋白E-cadherin的表达无关；但Rac1在口腔癌进展中的作用并不清楚。

表3 各组细胞中Wnt／β-catenin信号通路的相对表达量比较/x±s

表3 各组细胞中Wnt／β-catenin信号通路的相对表达量比较/x±s

*与未转染组比较，P＜0.01

-catenin c-Myc Bcl-2 Cleaved Caspase-3未转染组组别 β 0.68±0.05 0.74±0.05 0.57±0.03 0.26±0.03 siNC组 0.72±0.05 0.69±0.06 0.54±0.03 0.23±0.03 siRac1组 0.35±0.03* 0.42±0.03* 0.11±0.02* 0.68±0.05*F 62.898 38.100 270.955 132.488 P 0.000 0.000 0.000 0.000

本研究以人口腔鳞状细胞癌HSC-3细胞为研究对象，采用脂质体法转染siRNA-Rac1后成功下调HSC-3细胞中Rac1表达后，检测到HSC-3细胞的增殖和侵袭能力减弱，细胞凋亡能力增强。结果表明，靶向Rac1的siRNA可抑制HSC-3细胞的增殖、侵袭并诱导细胞凋亡。提示，Rac1通过调控癌细胞增殖、侵袭和凋亡，促进口腔癌的恶性进展。

细胞信号途径转导在口腔癌等多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和凋亡等过程中发挥着重要作用，而经典的Wnt／β-catenin转导途径就是其中之一。β-catenin是Wnt／β-catenin通路的关键调控因子，其过度积累进入细胞核，通过调控靶基因转录激活Wnt／βcatenin通路，参与肿瘤的发生发展［13，14］；c-Myc是Wnt／β-catenin通路下游的靶基因，也是一种原癌基因，在促进细胞增殖、侵袭和抑制凋亡等过程中发挥着重要作用［15，16］；Bcl-2是公认的抑凋亡蛋白，而Caspase-3是细胞凋亡的重要执行因子，两者是检测细胞凋亡的常见指标［17，18］。在髓母细胞瘤和胰腺癌中，活化的Rac1可通过促进β-catenin表达激活Wnt／β-catenin通路，进而促进肿瘤的恶性进展［19，20］。

为深入阐明Rac1调控口腔癌进展的分子机制，本研究进一步检测显示，在Rac1低表达的HSC-3细胞中β-catenin、c-Myc和Bcl-2蛋白的表达水平均明显降低，而Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平明显升高。结果表明，抑制Rac1可通过抑制Wnt／βcatenin信号通路活化抑制HSC-3细胞增殖、侵袭并诱导细胞凋亡。提示活化的Rac1可能通过激活Wnt／β-catenin信号通路促进口腔癌发生发展。

综上所述，Rac1在口腔癌的发生发展过程中发挥着重要的促进作用，靶向抑制其表达可通过Wnt／βcatenin信号通路抑制HSC-3细胞增殖、侵袭并诱导细胞凋亡，Rac1有望成为口腔癌治疗的潜在靶点。