黄连素对H9c2心肌细胞缺氧性损伤大鼠巨噬细胞功能的影响

王 鹏 郭志坤

缺血性心脏病、心脏手术后心功能不全最主要的病理基础之一为心肌缺血再灌注损伤（IR），一旦出现IR，将会影响临床治疗效果，对于如何防治IR成为医学研究热点课题。近年有研究报道，中药提取物黄连素（berbreine，BBR）可调控IR及促进炎症因子水平下降，这为临床治疗提供了一种治疗思路［1］。为了进一步探讨其应用价值，本研究就黄连素对H9c2心肌细胞缺氧损伤大鼠的巨噬细胞功能的调控作用及效果进行了探索。

1 材料与方法

1.1材料 本研究涉及的材料主要包括RMPI培养基、胎牛血清、巨噬细胞高迁移率族蛋白（HMGB1）抗体、CCK-8试剂盒、羊抗兔二抗抗体、罗丹明123、二甲基亚砜、胰蛋白酶等。

1.2方法

1.2.1细胞培养 从SD大鼠股骨骨髓前体细胞取原代培养骨髓性巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages，BMDM），以巨噬细胞集落因子 100 ng／ml刺激，持续6 d，诱导成研究所需BMDM；以RMPI1640培养基培养H9c2心肌细胞，并辅之以胎牛血清（10%），放于37℃、5%CO2温度计饱和湿度下，并完成心肌细胞生长及传代。

1.2.2吸光度值检测 采用CCK-8试剂盒检测。单独培养（仅BMDM）、联合培养（BMDM＋大鼠H9c2心肌细胞）均经10μmol／L BBR处理24 h。联合培养下，诱导成熟BMDM且消化心肌细胞重悬后，种植在BMDM孔板，根据每孔6×103个种植，共计96孔，经BBR处理后，加入稀释后的CCK-8，每孔均加入，孵育2～4 h，以紫外分光光度计检测吸光度值。

1.2.3HMGB1检测 以3×106个／孔，将大鼠BMDM种植在6孔板，经10μmol／L BBR处理24 h，在4℃下用蛋白酶抑制剂细胞裂解液（RIPA）进行40 min裂解，每孔加入120μl裂解液，收集后离心15 min，速率12 000 r／min，取上清液，用BCA法测定浓度。样本经电泳后转膜，3%BSA封闭，加一抗孵育过夜，温度4℃，TBST进行3次洗涤，加入二抗，室温下孵育2 h，洗涤后显影。

1.2.4炎性因子测定 利用Elisa法检测细胞炎性因子IL-6与IL-1β。

1.2.5H9c2细胞凋亡水平测定 用流式细胞仪测定H9c2细胞凋亡水平，联合培养细胞在24孔板，用BBR处理24 h，收集H9c2细胞，离心洗涤，用双染标记细胞后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，重复3次，取均值。

1.3统计学处理 采用SPSS 22.0处理数据；计量资料以x±s）表示，采用t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同培养细胞经BBR处理前后心肌细胞活性比较 单独培养BMDM、联合培养（BMDM＋大鼠H9c2心肌细胞）经10μmol／L BBR处理均无毒性作用（均P＞0.05）。见表1。

表1 BBR处理前后心肌细胞活性情况比较／（x±s）%

表1 BBR处理前后心肌细胞活性情况比较／（x±s）%

与处理前比较，*P＞0.05；联合培养与单独培养比较，△P＞0.05

组别 处理前 处理后t P单独培养 95.45±0.43 94.83±0.55*＞0.05 ＞0.05 0.2011＞0.05联合培养 93.84±1.47△94.74±0.52*△0.1992＞0.05 t 0.8932 0.0983 P

2.2HMGB1、炎性因子水平比较 与BBR处理前比较，处理后可显著降低HMGB1与炎性因子水平（均P＜0.05）。见表2。

表2 处理前后HMGB1、炎性因子水平比较/±s，pg／ml

表2 处理前后HMGB1、炎性因子水平比较/±s，pg／ml

处理时间 HMGB1 IL-6 IL-1β处理前689.53±58.77 576.45±20.35 860.53±20.34处理后 400.30±43.26 302.31±43.29 568.64±72.12 t 13.2093 12.1092 14.0027 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3对巨噬细胞凋亡的调控效果 联合培养中，10 μmol／L BBR处理后，可降低H9c2细胞荧光强度与心肌细胞凋亡率，即可调控巨噬细胞而降低缺氧细胞凋亡。见表3。

表3 联合培养不同条件处理下心肌细胞凋亡指标比较/±s

表3 联合培养不同条件处理下心肌细胞凋亡指标比较/±s

组别 荧光强度（AU） 凋亡率（%）缺氧组124.47±20.46 4.89±0.23 BBR处理组 59.65±8.44 1.74±0.06 t 4.3021 2.3894 P ＜0.05 ＜0.05

3 讨论

溶栓、冠脉介入及冠脉搭桥手术均属于治疗心肌梗死常用的手段，但在血管化后容易引发心肌缺血再灌注损伤，对预后会造成不利影响［2］，如何降低心肌梗死治疗后IR发生成为研究的热点。心肌细胞凋亡属于IR主要病理变化，长期心肌细胞凋亡会造成心肌舒张功能下降，进展后会合并心肌收缩功能障碍。因此，减少IR期心肌细胞损伤可作为预防这类不良事件的关键。

HMGB1是一类结合DNA的核内蛋白，对维持基因组稳定有着重要作用，当发生应激反应、细胞损伤后，细胞稳态被破坏时，从细胞中释放出来，伴随细胞坏死，主动表达增高，经细胞浆释放，多见于免疫细胞［3］，比如巨噬细胞，为此，该因子的升高与释放能促进机体抗炎与免疫功能调节。此外，该因子自身也有调控其他炎症因子分泌的作用，可见有着复杂的病理生理功能［4］。BBR属于传统中药黄连活性成分，证实有多类药理效果，可调节机体糖代谢、脂肪代谢，在糖尿病、肾病中治疗均有应用，但其主要应用领域为抗心血管氧化损伤，可影响P13K-Akt信号通路，影响心肌细胞自噬水平，降低缺血再灌注损伤，从而保护心肌细胞［5］。

在本研究中，将单纯 BMDM、BMDM联合大鼠H9c2心肌细胞培养进行了比较，结果显示，单独培养与联合培养经10μmol／L BBR处理均无毒性作用，可显著降低HMGB1与炎性因子水平（均P＜0.05）；联合培养中，10μmol／L BBR处理后，可调控巨噬细胞而降低缺氧细胞凋亡。

综上所述，H9c2心肌细胞缺氧损伤大鼠用BBR处理有一定的调控巨噬细胞与促炎症功能，进而达到修复缺损心肌细胞的作用，值得进一步探索。