高温胁迫下SmCCoAOMT正调控茄子果皮着色

吕玲玲 冯雪锋 李可 李威

摘  要  咖啡堿-辅酶A-O-甲基转移酶（caffeoyl-CoA-O methyltransferase， CCoAOMT）是木质素合成途径的关键酶，但其在逆境胁迫中也发挥重要作用。根据茄子基因组数据设计引物克隆了CCoAOMT，命名为SmCCoAOMT，其最大阅读框为564 bp，编码187个氨基酸，相对分子质量为20.95 ku。生物信息学分析发现SmCCoAOMT与其他植物的CCoAOMT序列同源性高达90.67%，同时具有CCoAOMT的全部保守序列。对其在不同果皮颜色茄子品种及35 ℃高温下果实不同发育时期的表达进行了qRT-PCR分析，结果表明SmCCoAOMT在果皮颜色深的茄子品种中的相对表达量高于在果皮颜色浅的品种中的表达量，说明SmCCoAOMT的表达量与茄子果色呈正相关;与常温对照相比，在花后10和20 d时，高温胁迫下SmCCoAOMT的表达量都显著下降，尤其是在花后10 d时，表达量仅为对照的9.23%，说明SmCCoAOMT表达量显著下调可能是导致果皮颜色变浅的原因之一。结果推测SmCCoAOMT在高温胁迫下茄子果皮颜色变浅的过程中起正调控作用。

关键词  茄子;SmCCoAOMT;高温胁迫;果皮着色中图分类号  S641.1      文献标识码  A

SmCCoAOMT Positively Regulates the Peel Coloring in Eggplant under High Temperature Stress

LYU Lingling¹， FENG Xuefeng²， LI Ke³， LI Wei³

1. Huaihua University， Huaihua， Hunan 418008， China; 2. Shangqiu University， Shangqiu， Henan 476000， China; 3. South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Provincial Key Laboratory for Postharvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract  Caffeoyl-CoA-O methyltransferase （CCoAOMT） is a key enzyme in the lignin synthetic pathway and also plays an important role in abiotic stresses. According to the eggplant reference genome，SmCCoAOMTwas cloned from eggplant. The maximum opening reading frame （ORF） ofSmCCoAOMTwas 564 bp， encoding 187 aa and its relative molecular weight was 20.95 ku. The bioinformation analysis indicated thatSmCCoAOMT showed 90.67% sequence identity withCCoAOMTs of other plants and had all the conservative sequences inCCoAOMT.The expressions in eggplants with different peel colors and at different stages of fruit development were analyzed by qRT-PCR. The results showed that the expression ofSmCCoAOMTwas significantly higher in purplish red and blackish purple peels than in white and green peels， which was positively correlated with peel color. Comparing to control， on the 10^thand 20^thdays after flowering （10DAF， 20DAF）， the expressions ofSmCCoAOMTwere significantly down-regulated under high temperature （HT） stess， especially on 10DAF， the expression decreased to 9.23%. Which might lead to the light peel color. The results suggested thatSmCCoAOMT positively regulated the peel coloring in eggplant under HT stress.

Keywords  eggplant;SmCCoAOMT; high temperature stess; peel coloring

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.025

茄子（Solanum melongena L.），茄科茄属类蔬菜，起源于印度，中国为第2起源地^[1]。茄子在我国南北均大面积栽培，但各地喜好的果形和颜色变化较大：在东北以绿色卵茄为主，华东地区主要是紫红线茄，在中原地区，主要以绿长茄为主，西南地区以紫茄为主，华南地区主要栽培紫红长茄^[2]。因此，果皮颜色成为茄子重要的育种目标之一。茄子果皮着色的最佳温度为20～25 ℃，华南地区5—6月份的高温天气易造成茄子果皮颜色变浅甚至完全变白、着色不均匀等问题^[3-4]，严重影响了茄子的外观品质，同时降低了茄子的商品价值。

咖啡碱-辅酶A-O-甲基转移酶（caffeoyl-CoA- O methyltransferase， CCoAOMT）属于植物氧甲基转移酶I类，此类蛋白的氨基酸序列有8个保守的基序，其中基序A[（V/I/L）（V/L）（D/K）（V/I）GG XX（G/A）]、B[（V/I/F）（A/P/E）X（A/P/G）DAXXXK（W/ Y/F）]、C[（A/P/G/S）（L/I/V）（A/P/G/S）XX（A/P/G/S） （K/R）（V/I）（E/I）（L/I/V）]是植物氧甲基转移酶所共有，其余5个为CCoAOMT所特有^[5]，这类酶的相对分子量较小。CCoAOMT为木质素合成过程中的关键酶，参与植物的木质化进程。CCoAOMT基因在植物抵御生物、非生物胁迫过程中也发挥重要作用。西瓜在干旱胁迫下CCoAOMT蛋白表达上调^[6]。玉米在干旱条件下CCoAOMT的活性被激活，表明木质素的生物合成与植物抗旱性强弱有关^[7]。烟草^[8]、水稻^[9]、拟南芥^[10]、龙眼^[11]中CCoAOMT在调控植物对干旱、低温或高盐等逆境胁迫的生理适应反应中发挥重要作用。

本课题组前期研究中（文章未发表），带花蕾的茄子植株经35 ℃高温（High temperature，HT）处理后进行转录组测序，发现高温下SmCCoAOMT在果实发育过程中显著下调表达，果皮颜色与常温对照（CK）相比也变浅，说明SmCCoAOMT与果皮着色密切相关。本文的目的是想阐明SmCCoAOMT在高温下茄子果皮着色中的作用，为全面了解高温下茄子果皮着色机理打下基础。

1  材料与方法

1.1材料

以田间筛选出来的高温条件下果皮颜色变浅的紫红长茄30#为材料。在相同栽培管理条件下，选取大小一致的植株20株，在授粉当天，高温处理（35 ℃ 12 h/25 ℃ 12 h）下培养10株，对照（CK）（25 ℃ 12 h/20 ℃ 12 h）条件下10株，12 h/12 h光暗交替培养。分别于开花后10、15、20 d（day after flowering， 10DAF， 15DAF， 20DAF）采样，削取茄子果皮，每个样3次重复，共计18个样，液氮速冻后?80 ℃保存，作为转录组测序材料，同时用于基因表达分析。另外在田间种植4个不同果色的茄子品种：19#（白色果皮）、30#（紫红果皮）、49#（绿色果皮）、59#（紫黑果皮），取成熟果实的果皮，3次重复，用于基因的表达分析。

1.2方法

1.2.1SmCCoAOMT的克隆  用北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAout 2.0试剂盒（產品编号为CAT#： 90404-50）来提取茄子果皮的总RNA，对RNA进行纯度和浓度检测后，利用反转录试剂盒（TaKaRa）合成cDNA第1链，作为随后PCR扩增的模板。根据茄子基因组数据（http：//eggplant.kazusa.or.jp/），利用Primer premier 5.0设计SmCCoAOMTcDNA全长扩增引物，QC-F：5?-ATGACCACCTCTGCCGATGAAG-3?，QC-R：5?-TTAACTGATGCGGCGACAAAGA-3?。反应体系为：PCR缓冲液12.5 μL，8.4 μL灭菌去离子水，0.1 μLTaq酶，正向、反向引物各1 μL（10 μmol/L），cDNA模板2 μL;PCR扩增条件为：94 ℃变性3 min;94 ℃变性0.5 min，58 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸2 min，32个循环;72 ℃延伸10 min。将目的片段连接到pMD19-T上并转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆送华大基因测序。

1.2.2SmCCoAOMT的生物信息学分析  从NCBI上选取马铃薯、辣椒、番茄、烟草、可可树、茄子等植物的CCoAOMT氨基酸序列，利用DNAMAN软件分析其同源性。利用ClustalX 2与MEGA5软件和Neighbor-Joining方法构建茄子SmCCoAOMT与NCBI中已经登录的高等植物的CCoAOMT进化树。

1.2.3SmCCoAOMT的表達分析  以18s rRNA为内参基因^[12]，对SmCCoAOMT基因在不同果皮颜色茄子品种及果实不同发育时期的表达进行qRT-PCR分析。定量取出1 ?g RNA，使用TaKaRa定量反转录试剂盒进行反转录，得到的cDNA用作定量表达的模板。SmCCoAOMT定量表达的引物，dl-up：GGTGGGCTAATTGGCTATGA，dl-dn：AGGAAGCTGGCAGATTTCAA。反应体系：95 ℃ 30 s，1个循环;95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。如果制作标准曲线，最后再添加一个溶解曲线的反应：95 ℃ 60 s，58 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，1个循环。

1.3数据处理

采用SPSS 19.0软件对试验数据进行Duncant检验。

2  结果与分析

2.1SmCCoAOMT cDNA全长克隆及其生物信息学分析

通过PCR扩增和测序鉴定，得到SmCCoA OMT基因cDNA全长（图1），其最大阅读框为564 bp，编码187个氨基酸（图2），相对分子质量为20.95 ku。

2.2SmCCoAOMT的生物信息学分析

利用DNAMAN对马铃薯、辣椒、番茄、烟草、可可树、茄子等植物CCoAOMT氨基酸序列的同源性进行分析（图3）。结果发现茄子CCoAOMT与其他物种的CCoAOMT序列同源性高达90.67%，与马铃薯的同源性最高。同时茄子SmCCoAOMT具有CCoAOMT的全部保守序列（红色方框标示）。

利用ClustalX 2与MEGA5软件和Neighbor- Joining方法构建茄子SmCCoAOMT与NCBI中部分高等植物的CCoAOMT进化树，结果显示：茄子与甜椒、马铃薯最先归为一类，亲缘关系较近，其次是葡萄、烟草与矮牵牛，而与毛白杨的亲缘关系较远（图4）。

2.3SmCCoAOMT的表达分析

2.3.1SmCCoAOMT在不同果色茄子品种中的表达  SmCCoAOMT在紫黑果皮59#品种中表达量最高，其次是紫红果皮30#品种，在绿色果皮49#和白色果皮19#中的表达量显著低于前2个品种（图5），即在颜色深的茄子品种中的相对表达量高于在颜色浅的茄子品种中的表达量，说明SmCCoAOMT的表达量与茄子果色呈正相关。

2.3.2SmCCoAOMT在果实不同发育时期的表达  常温下，SmCCoAOMT在果实不同发育时期的表达量呈先降后升的趋势;高温下SmCCoAOMT的表达量在果实发育的3个时期变化不大，但与常温对照相比，在10DAF和20DAF时，其表达量都显著下降，尤其是在10DAF时，表达量仅为常温对照的9.23%。在果实发育早期，SmCCoAOMT表达量的显著下调可能是导致果皮着色不良的原因之一。

3  讨论

在茄科蔬菜苯丙烷类代谢过程中，含苯丙烷骨架的物质，如绿原酸、木质素、花青素、原花青素等都是以苯丙氨酸为合成前体^[13]。此代谢途径有2大分支，都是以肉桂酸、香豆酸为中间产物，一类是在查尔酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）的作用下进入花青素合成途径，另一类则是在CCoAOMT的作用下进入木质素合成途径（图7），CHS和CCoAOMT就成了进入这2个途径的关键酶。

CCoAOMT所介导的甲基化反应使花青素酚羟基的反应活性降低、稳定性增强，使花青素不断积累，使花、果实等组织呈现各种不同的颜色^[15]。

红色方框内为植物CCoAOMT的保守序列元件。

Red-boxes are popular conserved sequence elements in plant CCoAOMTs.

NP001305508.1： Solanum tuberosum; AAF44689.1： Populus tomentosa; APX43200.1：Populus tomentosa; XP002298729.1：Populus trichocarpa; ALR35193.1：Fraxinus mandshurica; PON82039.1：Trema orientale; BAE48788.1：Codonopsis lanceolata; XP017233504.1：Daucus carotasubsp. sativus; XP012831062.1：Erythranthe guttata; AAT75320.2：Boehmeria nivea; AAS91565.1：Broussonetia papyrifera; XP006856484.1：Amborella trichopoda; AFD23679.1：Salvia miltiorrhiza; XP007047308.1：Theobroma cacao; XP010263488.1：Nelumbo nucifera; XP010270267.1：Nelumbo nucifera; XP002282867.1：Vitis vinifera; XP016561061.1：Capsicum annuumvar. grossum; ALP75647.1： Petunia × hybrid; XP019251878.1：Nicotiana attenuata; AFS33547.1：Nicotiana tabacum

李晓峰等^[16]的研究发现，CCoAOMT的上调表达会使‘砀山酥梨果皮由黄绿色变成褐色;psCC oA OMT是引起?果实褐变的主要基因之一^[17];将PhCCoAOMT1转入只开白花的‘Mitchell矮牵牛品种中，发现转基因植株叶片變紫，花色由白色变成粉红色^[18]。本次研究中，SmCCoAOMT在颜色深的茄子品种中的相对表达量显著高于在颜色浅的茄子品种中的表达量;在高温胁迫下的果

NP001305508.1： Solanum tuberosum; AAF44689.1： Populus tomentosa; APX43200.1：Populus tomentosa; XP002298729.1：Populus trichocarpa; ALR35193.1：Fraxinus mandshurica; PON82039.1：Trema orientale; BAE48788.1：Codonopsis lanceolata; XP017233504.1：Daucus carotasubsp.sativus; XP012831062.1：Erythranthe guttata; AAT75320.2：Boehmeria nivea; AAS91565.1：Broussonetia papyrifera; XP006856484.1：Amborella trichopoda; AFD23679.1：Salvia miltiorrhiza; XP007047308.1：Theobroma cacao; XP010263488.1：Nelumbo nucifera; XP010270267.1：Nelumbo nucifera; XP002282867.1：Vitis vinifera; XP016561061.1：Capsicum annuumvar. grossum; ALP75647.1： Petunia × hybrid; XP019251878.1：Nicotiana attenuata; AFS33547.1：Nicotiana tabacum.

不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

Different lowercase letters indicate a significant difference determined by the Duncan test （P<0.05）.

实发育过程中，SmCCoAOMT表达量下降，茄子果皮颜色也变浅，推测SmCCoAOMT是影响茄子果色形成的关键基因之一。Sugar等^[19]的研究认为，在梨果实发育过程中，一旦受到逆境胁迫，CCoAOMT表达量就会下降，导致果实表皮细胞

不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

Different lowercase letters indicate a significantdifference （P<0.05）.

CHI： Chalcone isomerase; CHS： Chalcone synthase; PAL： Phenylalanine ammonialyase; DFR： Dihydroflavonol reductase; F3H： Flavanone 3-hydroxylase; ANS： Anthocyanidin synthase.

老化，果肉细胞增大不一致，使气孔保卫细胞破裂后形成的空洞内产生次生保护组织，导致细胞壁增厚，外层细胞破损，进而形成果点，造成果皮木栓化，从而引起果皮颜色变浅、有斑点、着色不均匀。本研究结果与其结果一致，但其具体的调控机制有待进一步研究。

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