野生蕉不同颜色果皮miRNA表达谱及靶基因分析
2019-12-14邓素芳程春振林玉玲赖钟雄
邓素芳 程春振 林玉玲 赖钟雄
摘 要 本文以閩侯野生蕉（阿宽蕉，Musa itinerans）果皮为研究对象，对不同颜色（绿色和紫色）果皮进行转录组测序，旨在探讨miRNA在野生蕉不同颜色果皮转录后水平中发挥的作用及其可能参与的调控通路，为芭蕉属植物果皮颜色分子调控机制的研究奠定基础。取野生蕉同一果梳上不同颜色（紫色和绿色）的果皮为材料，利用高通量测序和生物信息学分析，获得野生蕉不同颜色果皮组织的miRNA表达谱，筛选不同颜色果皮差异表达的miRNA并预测相关靶基因，通过靶基因分析，获得与调控野生蕉果皮颜色可能相关的信号通路。结果从不同颜色野生蕉果皮中共获得34.11兆条原始读长，经过滤后得到28.73兆条clean reads，从中鉴定出132个已知的miRNA序列和122个新的miRNA;筛选出36个差异表达miRNA，其中10个在紫色果皮中上调表达，26个在绿色果皮中上调表达。表达量最高的miRNA为mit-miR167，而差异倍数最大的为mit-miR172a-3p-2。差异表达miRNA共预测出1164个靶基因可能参与野生蕉果皮颜色调控，并主要在DNA结合、离子跨膜运输活动等功能和植物病原互作等途径富集。其中，有7个基因直接与苯丙烷生物合成途径相关，主要受到miR156和miR482家族的调控。同时，选取6个差异表达miRNA进行定量验证，结果表明，3个miRNA在绿色果皮中上调表达，3个miRNA在紫色果皮中上调表达，定量结果与高通量测序的结果一致。本文通过高通量测序获得了野生蕉果皮miRNA表达谱，并通过生物信息学分析得到可能和调控野生蕉果皮颜色性状相关的miRNA和代谢通路。综上所述，野生蕉果皮颜色可能受到多种miRNA的调控，并涉及多个代谢通路，这有助于进一步了解果皮花青素转录后水平的调控过程，并对进一步的功能验证奠定基础。
关键词 野生蕉;果皮;花青素;miRNA;差异表达中图分类号 S686; S668.1 文献标识码 A
miRNA Expression Profile and Target Gene Analysis of Different Color Peels in Wild Banana （Musa itinerans）
DENG Sufang1，2， CHENG Chunzhen1， LIN Yuling1， LAI Zhongxiong1*
1. Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. Agricultural Ecology Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350013， China
Abstract In this paper， the transcriptome sequencing of different color peels （green and purple） of Minhou wild banana （Musa itinerans） was carried out to investigate the role and the possible regulatory pathways of miRNA involved in the post-transcriptional level regulation of peel color， which would lay the foundation for the study of the peel color molecular regulation mechanism of the genusMusa. In the experiment， different color （purple and green） peel tissues on the same fruit comb of wild banana were used for miRNA analysis. Through miRNA sequencing and bioinformatics analysis， the miRNA expression profiles of different color peel tissues in wild banana were obtained. The differentially expressed miRNAs were screened and the related target genes were predicted. Through the target gene analysis， the signal pathways which is related to peel color traits were proposed. As a result， a total of 34.11 million original reads and 28.73 million clean reads were obtained from the green and purple peel tissues. Among them， 132 known miRNAs and 122 new miRNAs were identified; 36 differentially expressed miRNAs were screened out， of which 10 were up-regulated in purple peel and 26 were up-regulated in green peel. The miRNA with the highest expression was mit-miR167， and the one with the largest difference was mit-miR172a-3p-2. A total of 1164 target genes of differentially expressed miRNAs were predicted， which may be involved in the regulation of wild banana peel color， and were mainly enriched in functions such as DNA binding， anion transmembrane transporter activity， and plant pathogen interaction pathways. Among them， there were 7 genes directly related to the phenylpropanoid biosynthesis pathway， and were mainly regulated by the miR156 and miR482 families. At the same time， six differentially expressed miRNAs were selected for quantitative verification. The results showed that three miRNAs were up-regulated in green peel and three miRNAs were up-regulated in purple peel. The quantitative results were consistent with the results of high-throughput sequencing. In this study， the miRNA expression profiles of wild banana peels were obtained， and the miRNAs and metabolic pathways which may be related to the regulation of color traits of wild banana peel were obtained by bioinformatics analysis. These results indicated that the color trait of wild banana peel may be regulated by a variety of miRNAs and involves multiple metabolic pathways， which would help to further understand the post-transcriptional level regulation of anthocyanins in the peel and lay the foundation for further functional verification.
Keywords Musa itinerans; peel; anthocyanin; miRNA; differential expression
DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.010
分布于我国华南地区的野生蕉——阿宽蕉（Musa itinerans）是一类观叶、观果的芭蕉属植物，广泛应用于园林绿化中。福建野生蕉资源非常丰富，许多野生蕉因富含花青素[1]而具有紫红色的果实，观赏性很强，为芭蕉属植物观赏性状改良提供了优异的基因资源。花青素作为一种水溶性天然可食用色素，不仅在植物显色及生长发育中起作用，还具有医疗保健功效，是植物观赏性状和品质改良的一个重要研究内容。随着分子生物学的快速发展，植物花青素的生物合成途径已经比较明确，但花青素生物合成调控的分子机制非常复杂，除了受结构基因和转录因子的共同调控外，近年来的许多研究也表明miRNAs可以通过靶向调控花青素合成的MYB、bHLH和WD40等多种转录因子，实现对花青素的转录后水平调控。如在拟南芥中，miR156的靶基因SPL9通过降低MBW复合物的稳定性来抑制花青素的合成和积累[2];miR827通过调控靶基因NLA参与花青素的生物合成[3];miR858通过靶基因MYB12调控黄酮类物质的生成途径来影响花青素的生物合成[4-5];miR828通过对TAS4剪切产生许多siRNA，共同靶向花青素合成相关的PAP1/MYB75、PAP2/MYB90、MYB113，从而影响花青素的合成[6-7]。此后，有越来越多的研究表明miRNA参与植物花青素的转录后调控[8-9]。
随着高通量测序技术的快速发展，应用测序技术在鉴定花青素合成相关miRNA方面的研究也越来越多，也筛选出了一些和花青素相关的miRNA[9-10]，但在芭蕉属植物果皮颜色方面的筛选工作鲜有报道。而通过高通量测序技术获得野生蕉不同颜色果皮miRNA表达谱，并筛选和果皮花青素合成相关miRNA，对系统研究野生蕉转录后调控花青素具有重要的意义。因此，本研究通过对野生蕉不同颜色果皮进行miRNA-Seq高通量测序，挖掘可能调控野生果皮颜色的miRNA，为后续研究野生蕉果皮颜色调控的分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1材料
系列试验所用材料均为种植于福建农林大学园艺植物生物工程研究所试验地的闽侯野生蕉[11]。该野生蕉为通信作者于2011年在闽侯三叠井采集后移栽至试验基地。经过几年的观察，果皮紫色性状稳定。试验取同一果树上不同颜色（绿色和紫色）的果皮组织，用编号GP表示绿色果皮，PP表示紫色果皮，见图1。
1.2方法
1.2.1 样品采集、RNA的提取、文库构建与测序 取树上刚采下的野生蕉果梳，用削皮刀剥下表面带颜色的果皮，在液氮下迅速研磨成粉末，用北京天恩泽公司生产的柱式植物RNAOUT 2.0试剂盒（Column Plant RNAOUT 2.0 Kit）提取總RNA后，交由北京百迈客生物科技有限公司进行文库构建，并在Illumina Hiseq 2500平台进行测序。
1.2.2 数据处理 （1）将测序得到的原始序列去除接头序列和短于18 nt或长于30 nt的序列等低质量序列，获得高质量序列（即clean reads）用于后续分析。（2）Bowtie（http：//bowtie-bio. Source forge.net/），用于序列比对，获得包含miRNA的Unannotated reads。（3）将Unannotated reads与植物miRNA数据库（miRbase 20.0，http：//www. MiRb ase.org/）中的已知miRNA进行比对，获得保守miRNA的数目及家族分布。同时使用Musa_Itinerans_v1作为参考基因组（http：// banana- genome-hub.southgreen.fr/organi sm/ Mu sa/Itinerans）进行新的miRNA预测、序列比对和后续分析。（4）用TPM算法归一化处理miRNA的表达量，对2个样本中miRNA表达量进行统计。差异表达miRNA的筛选以校正后的p-value即错误发现率FDR（false discovery rate）≤0.05，2个样本间表达量差异倍数FC在2倍以上即|log2（FC）|≥1作为条件。（5）对得到的miRNA（已知的miRNA和新预测的miRNA）用Target Finder软件进行靶基因预测。（6）用DAVID 软件（http：//david.abcc. Ncifc rf. gov/）进行KEGG通路分析和GO分析，用富集因子（enrichment factor）分析差异表达miRNA靶基因的KEGG通路富集程度。
1.2.3 cDNA及引物的合成 对提取的总RNA用北京全式金生物技术有限公司生产的miRNA反转录试剂盒（TransScript miRNA RT Enzyme Mix）进行cDNA的合成。用ABI公司的Primer Express Software v2.0设计候选基因用于荧光定量PCR的引物，委托深圳华大基因公司合成引物，引物序列信息见表1。
1.2.4 Real-time qPCR分析 用Real-time qPCR检测野生蕉不同颜色果皮中差异表达miRNA的
相对表达量。反应体系包括5 mL Nuclease-Free Water、8 μL 2×SYBGEEN PCR mix（QIAGEN）、1 μL上游引物、1 μL下游引物、1 μL样品cDNA，构成总体积为20 μL反应体系。反应条件为95 ℃变性2 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，50个PCR循环，采用默认设置自动生成Ct值。RT-qPCR相对定量的内参选择U6。每个样品设置3个重复。以绿色果皮的基因表达量为对照，用相对定量2-ΔΔCt法计算分析基因的表达水平。
2 结果与分析
2.1测序数据质量评估
通过高通量测序，从GP和PP 2个小RNA文库中分别获得了14 505 778和19 523 133条原始reads，原始数据已上传至NCBI SRA数据库，登录号分别为SRR9945688和SRR9945687。去除低质量读数、未知碱基N含量≥10%读数、接头序列、poly（A）读数以及短于18 nt或长于30 nt的读段后，分别获得11 311 826和17 420 104条clean reads，占原始reads的77%以上（表2）。
利用Bowtie软件将clean reads与Silva、GtRNAdb、Rfam和Repbase数据库进行比对，去除了rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和重复序列后，获得了包括miRNA在内的未经注释reads，这部分数据分别占2个文库总小RNA原始reads的67.05%和71.52%（图2）。此外，2个数据集中rRNA的比例小于31%，表明2个sRNA文库的质量很高。未注释reads中，2个文库（GP和PP）与Musa itinerans基因组相匹配的reads分别占54.54%和55.52%。
许多研究表明，不同长度的小RNA具有不同的功能。例如，21 nt的小RNA通常调控转录后的基因沉默，而24 nt的小RNA通过RNA依赖的DNA甲基化和异染色质维持介导基因的沉默[12-13]。因此，我们调查了2个文库小RNA序列的长度分布，结果表明，2个文库小RNA序列的长度分布相似，主要在18 nt到30 nt长度之间变化（图3）。长度在21～24 nt的小RNA序列，占全部数据的60%以上。2个文库中24 nt小RNA均占优势，分别占总数据的28.08%（GP）和28.93%（PP）。典型的21 nt长度的miRNA，在2个小RNA文库中的数量位居第二，分别占14.51%（GP）和18.99%（PP）。这些结果与在拟南芥[14]、水稻[15]、普通小麦[16]、大豆[17]、苹果[18]、茄科茄
属[19]和萝卜[20]等成熟植物觀察到的小RNA长度分布一致。另外，在紫色果皮中，长度小于或等于24 nt的小RNA比绿色果皮中的多，特别是21 nt小RNA的丰度差异尤为显著;长度大于24 nt的小RNA相对丰度则相反，在绿色果皮中要比在紫色果皮中的多。
2.2野生蕉果皮miRNA的鉴定
使用Ssearch36软件将与基因组匹配的读本与miRBase（V21.0）数据库中已知的植物成熟miRNA进行比对，获得闽侯野生蕉保守的miRNA序列，结果共鉴定出132个已知的miRNA序列和122个新的miRNA。对获得的254个miRNA序列进行miRNA家族分析，研究这些miRNA在进化中的保守性。结果表明，这些基因来自58个miRNA家族（图4）。这些保守的miRNA家族成员数目显著不同。例如，miR156家族成员数量最多，有21名成员，其次是miR396和miR171-1家族，分别有20名和18名成员。
从各miRNA家族表达量统计结果来看，miR159、miR319家族的miRNA表达总量显著高于其他家族（图5）。统计结果表明家族成员多的基因家族总表达量不一定多，如miR319家族只有6个成员，但它的表达量却位于所有miRNA家族的第2位。表达量前10位的miRNA见表3。
由于miRNA长度影响其调控作用，我们统计了254个miRNA的长度分布范围。结果表明，所鉴定的miRNA长度在18～25 nt范围内分布，其中长度为21 nt的miRNA所占比例最高，为48.03%，另有19.29%的miRNA长度在24 nt，而18 nt的miRNA所占的比例最低，为0.39%;已知的132个miRNA长度分布相对较集中，范围在19～22 nt之间，其中20 nt和21 nt的miRNA占了85.61%;122个新的miRNA长度分布范围同总的miRNA分布范围一致，18～25 nt的miRNA都有，其中，24 nt长度的miRNA数量最多，占40.16%，其次是20 nt的miRNA，占33.61%（图6）。
2.3不同颜色果皮差异表达的miRNA分析
为了了解果皮2种颜色差异表达的miRNA，用绿色果皮为对照，计算Log2FC，以校正后的P-value（FDR）≤0.05，|log2（FC）|≥1为标准，筛选出
2种颜色果皮差异表达的miRNA，结果从新鉴定的254个野生蕉果皮miRNA中，筛选出36个差异表达的miRNA，它们来源于16个已知的miRNA家族，结果如图7所示。这36个差异表达的miRNA中，有10个在紫色果皮中上调表达，26个在绿色果皮中上调表达。
为了更直观地了解野生蕉果皮差异表达miRNA的表达情况，对筛选出的差异表达miRNA做层次聚类分析，将具有相同或相似表达行为的miRNA进行聚类，结果见图8。从图8可以看出，这36个miRNA在不同颜色的果皮中具有差异表达模式，根据表达量及差异显著性可以划分为4类：（1）平均表达量TPM<20的miRNA有9个，包括mit-miR157d-3p、mit-miR172a-3p-2、mit- miR160-5p、mit-miR482-2、mit-miR156f-5p、mit- miR156b-5p、mit-miR156、mit-miR399和mit- miRn4;（2）平均表达量20
2.4差异表达miRNA靶基因的预测与注释
为了更好地了解不同颜色野生蕉果皮差异表达miRNA的功能，用Target Finder软件对在不同
颜色果皮中差异表达的36个miRNA进行了靶基因预测，考察了它们的功能注释和富集情况。结果表明，36个差异表达的miRNA共预测到1164个靶基因，其中有1085个靶基因获得公共数据库的注释。其中，经过与GO数据库比对，共有482个差异表达miRNA的靶基因获得注释。这些靶基因分布在40个GO功能二级分类中，结果见图9。差异表达miRNA的靶基因功能主要涉及生物学过程分类中的代谢过程、细胞过程和单一有机体过程，细胞组分分类中的细胞部分、细胞和生物体，分子功能分类中的结合和催化活性等GO功能条目。
通过差异miRNA靶基因的KEGG注释结果统计，共有371个靶基因注释到KEGG的酶，其中有198个靶基因关联到59个KEGG代谢通路上，如图10所示。其中，涉及植物-病原互作、植物激素信号传导、核糖体和氨基酸生物合成等4个具体途径的靶基因数较多。而注释到次生代谢物合成的靶基因，主要集中在苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）途径中，包含预测出的7个靶基因。
在苯丙烷生物合成通路中（图11），多数目标基因集中在苯丙烷生物合成的下游，其中4个基因在紫色果皮中下调表达，3个基因上调表达，且这些差异表达miRNA的靶基因主要受到miR156和miR482家族的调控。可以看到，一个
靶基因受到多个miRNA的共同调控，而同一个家族的miRNA可以调控多个靶基因。
2.5差异表达miRNA靶基因GO功能和KEGG通路富集分析
为了更好地描述不同颜色果皮中检测到的差异表达miRNA靶基因，将预测出的靶基因进行了GO功能和KEGG途径富集分析。结果表明，差异表达miRNA靶基因主要在DNA结合（DNA binding）、离子跨膜运输活动（anion transmembrane
transporter activity）、高渗的响应（hypero smotic response）、DNA代谢过程（DNA metabolic process）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、有机离子转运（organic anion transport）、细胞分化（cell differentiation）和蛋白磷酸化（protein phosphorylation）等8个生物学过程显著富集（表4）。
KEGG通路富集分析表明，差异表达miRNA靶基因主要在植物-病原互作通路富集，富集因子达1.93（图12）。
2.6差异表达miRNA靶向的转录因子分析
鉴于植物miRNA具有倾向于靶定转录因子
的特点，本文考察了差异表达miRNA的靶基因中转录因子的情况，结果找到了160个靶基因与转录因子有关，其中有65个注释为MYB/MYB- related基因，19个注释为bHLH，3个注释为WD40，12个注释为WRKY，17個注释为AP2基因，35个注释为SPL（图13）。将野生蕉果皮中靶定转录因子的miRNA进行统计，结果表明，注释为MYB转录因子的靶基因主要是由
miR159、miR858和miR482等家族調控，注释为转录因子AP2的靶基因主要是由miR172和miR482家族调控，注释为SPL转录因子的靶基因主要是由miR156和miR535家族调控，注释为bZIP的靶基因主要是由miR396和miR482家族调控（表5）。
2.7差异表达miRNA定量PCR验证
为了验证RNA-seq获得的miRNA表达模式，选取了6个在野生蕉不同颜色果皮中差异表达的miRNA（mit-miR156k、mit-miR319c、mit-miR167 b-5p、mit-miR166a、mit-miR528-5p、mit-miR 858b）进行RT-qPCR，将2种分析结果（RNA-seq和RT-qPCR）进行比较，进行定量验证（图14）。结果表明，供试的6个基因中，mit-miR156k、
mit-miR166a、mit-miR528-5p在绿色果皮中上调表达，而mit-miR319c、mit-miR 167b- 5p、mit-miR 858b 3个miRNA在紫色果皮中上调表达，与高通量测序的结果一致。
3 讨论
3.1野生蕉果皮miRNA具有品种特异性
Ghag等[21]在2个栽培香蕉品种Grand Naine（AAA subgroup Cavendish）和Rasthali（AAB subgroup Silk）的研究中，发现了miRNA具有明显的品种特异性，2个品种分别具有44%～53%的特异性miRNA。宋顺等[22]在3个植物保守miRNAs响应香蕉不同品种（巴西蕉、大蕉、皇帝蕉）的抗枯萎病特性表达分析中也发现miRNA具有明显的品种特异性。本研究利用RNA-seq测序技术，共从野生蕉果皮中鉴定了254个miRNA，其中132个miRNA具有保守miRNA序列，比对上已知的其他物种miRNA，而有122个miRNA为野生蕉果皮特异的，占总数的48.03%。此外，本研究获得的miRNA中，保守的已知miRNA以21 nt长度为主，野生蕉特异的新的miRNA以24 nt为主，21 nt次之，这与2个栽培香蕉品种Grand Naine （AAA subgroup Cavendish）和Rasthali （AAB subgroup Silk）的miRNA长度也有所不同，它们24nt miRNA数量远大于其他长度的miRNA数量[21]，但却与香蕉Musa acuminataColla（AAA Group）cv. Berangan 根中的miRNA长度分布一致[23]。这些都证实了芭蕉属植物miRNA具有明显的品种特异性。
3.2 可能参与野生蕉果皮花青素合成的miRNAs
通过对差异表达miRNA的靶基因GO功能和KEGG途径富集分析显示，靶基因主要在DNA结合和离子跨膜运输活动等功能和植物病原互作等途径富集，也有一些靶基因富集在苯丙烷代谢途径中，有些靶基因可能是参与花青素合成的MYB、bHLH、WD40、WRKY、SPL、AP2等转录因子，暗示野生蕉果皮颜色调控的分子机制复杂而多样。
在不同颜色果皮中我们共获得36个差异表达的miRNA，它们多数（26个miRNA）在紫色果皮中呈下调表达，而上调表达的基因主要来自miR160、miR167-1、miR171-1、miR399、miR482和miR5272家族的10个成员。已有研究报道Sly-miR167在番茄果实破色期的丰度增强[24]，在我们的研究中预测到的miR167-1（mit-miR 167b-5p、mit-miR167）在紫色果皮中表达量TPM大于3000，这2个miRNA可能与Sly-miR167一样，在果皮花青素的合成中起调控作用，但这些都还需进一步通过试验验证。
另外，通过差异表达miRNA靶基因的预测也发现，野生蕉果皮中表达的miRNA159/miRNA 319和miRNA858b靶定的基因，同陆地棉等植物一样[25]，也多数是编码MYB转录因子的基因，可能参与植物花青素的调控。许多证据证明，miRNA858调控与花青素相关的MYB基因的表达，如番茄中miR858能在转录后水平通过对靶基因Sly-MYB12和Sly-myb-like的作用负调控花青素的生物合成。通过与转录组数据[26]的关联分析也发现野生蕉果皮靶向MYB的miRNA也有miRNA858b，而且它在紫色果皮中上调表达，但差异未能达到显著（log2FC=0.96），它是否在野生蕉果皮颜色调控中起作用还需更进一步的研究。此外，研究中还发现2个属于miR482家族的miRNA（mit-miR482-1、mit-miR482-2）靶向调控MYB基因，但目前研究表明，miR482家族主要靶向NBS-LRR病害抗性基因，而对MYB基因的调控尚未见报道。总而言之，以上这些预测均需进一步的研究才能证实。
参考文献
[1] 邓素芳， 王天池， 赖钟雄. pH 示差法测定野生蕉果皮花青素含量[J]. 中国南方果树， 2014， 43（2）： 5-7.
[2] Gou J Y， Felippes F F， Liu C J， et al. Negative regulation ofanthocyanin biosynthesis in Arabidopsis by a miR156- targetedSPL transcription factor[J]. The Plant Cell， 2011， 23（4）：1512-1522.
[3] Chiou T J. The role of microRNAs in sensing nutrientstress[J]. Plant， Cell & Environment， 2010， 30（3）： 323-332.
[4] Mehrtens F， Kranz H， Bednarek P， et al. The Arabidopsistranscription factor MYB12 is a flavonol-specific regulatorof phenylpropanoid biosynthesis[J]. Plant Physiology， 2005，138（2）： 1083-1096.
[5] 陳晓婷， 刘 军， 孙翠霞， 等. 草酸胁迫下拟南芥三个差异表达microRNA 的分析[J]. 农业生物技术学报， 2014，22（4）： 432-439.
[6] Borevitz J O， Xia Y， Blount J， et al. Activation tagging identifiesa conserved MYB regulator of phenylpropanoid biosynthesis[J]. The Plant Cell， 2000， 12（12）： 2383-2393.
[7] Butelli E， Titta L， Giorgio M，et al. Enrichment of tomato fruit with health-promoting anthocyanins by expression of select transcription factors[J]. Nature Biotechnology， 2008， 26（11）： 1301-1308.
[8] 贾小云， 刘 慧， 沈 洁， 等. MicroRNA828负调控缺磷胁迫诱导的番茄花青素生物合成[J]. 中国农业科学， 2015， 48（15）： 2911-2924.
[9] 魏梦苒. 芍药花色形成相关miRNA的挖掘及功能分析研究[D]. 扬州： 扬州大学， 2017：64， 91.
[10] 赵怀宁. 桑椹花青素合成相关miRNAs的鉴定及其功能研究[D]. 泰安： 山东农业大学， 2018： 36-75.
[11] Deng S ， Cheng C ， Liu Z ，et al. Comparative transcriptome analysis reveals a role for anthocyanin biosynthesis genes in the formation of purple peel in Minhou wild banana （Musa itineransCheesman）[J]. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology， 2019， 94（2）： 184-200.
[12] Schreiber A W， Shi B J， Huang C Y，et al.Discovery of barley miRNAs through deep sequencing of short reads[J]. BMC Genomics， 2011， 12（1）： 129.
[13] Duan H， Lu X， Lian C，et al. Genome-wide analysis of microRNA responses to the phytohormone abscisic acid inPopulus euphratica[J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7： 1184.
[14] Rajagopalan R， Vaucheret H， Trejo J，et al. A diverse and evolutionarily fluid set of microRNAs inArabidopsis thaliana[J]. Genes & Development， 2006， 20（24）： 3407- 3425.
[15] Zhu Q H， Spriggs A， Matthew L，et al. A diverse set of microRNAs and microRNA-like small RNAs in developing rice grains[J]. Genome Research， 2008， 18（9）： 1456-1465.
[16] Han R， Jian C， Lv J，et al. Identification and characterization of microRNAs in the flag leaf and developing seed of wheat （Triticum aestivumL.）[J]. BMC Genomics， 2014， 15（1）： 289.
[17] Song Q X， Liu Y F， Hu X Y， et al. Identification of miRNAsand their target genes in developing soybean seeds by deepsequencing[J]. BMC Plant Biology， 2011， 11（1）： 5.
[18] Xia R， Zhu H， An Y， et al. Apple miRNAs and tasiRNAswith novel regulatory networks[J]. Genome Biology， 2012，13（6）： R47.
[19] Jin W， Wu F. Characterization of miRNAs associated withBotrytis cinerea infection of tomato leaves[J]. BMC PlantBiology， 2015， 15： 1.
[20] Wang Y， Liu W， Shen H， et al. Identification of radish（Raphanus sativus L.） miRNAs and their target genes to exploremiRNA-mediated regulatory networks in lead （Pb）stress responses by high-throughput sequencing and degradomeanalysis[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2015，33（3）： 358-376.
[21] Ghag S B， Shekhawat U K， Ganapathi T R. Small RNAprofiling of two important cultivars of banana and overexpressionof miRNA156 in transgenic banana plants[J]. PLoSOne， 2015， 10（5）： e0127179.
[22] 宋 顺， 黄东梅， 李艳霞， 等. 3 个植物保守miRNAs 响应香蕉不同品种的抗枯萎病特性表达分析[J]. 基因组学与应用生物学， 2015， 34（12）： 2728-2732.
[23] Lee W S， Gudimella R， Wong G R， et al. Transcripts andmicroRNAs responding to salt stress in Musa acuminataColla （AAA group） cv. Berangan roots[J]. PLoS One， 2015，10（5）： e0127526.
[24] 苗 青. 番茄Sly-miR167 啟动子的分离与调控分析[D].重庆： 重庆大学， 2011： 29-32.
[25] 安文燕. 陆地棉矮秆突变体的转录组和小RNA 测序分析[D]. 武汉： 华中农业大学， 2014：45.
[26] 邓素芳. 基于RNA-Seq 的野生蕉（Musa itinerans）果皮颜色差异形成的分子机制研究[D]. 福州： 福建农林大学，2018： 140.
