光周期对龙眼胚性愈伤组织类黄酮类胡萝卜素含量及合成相关基因的表达影响

朱宁，焦楠，张舒婷，李晓斐，赖钟雄

（福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州350002）

龙眼（Dimocarpus longanLour）是无患子科龙眼属的木本植物，别名桂圆、益智，其种植面积在我国水果大类中排名第六[1]。龙眼果肉营养价值高，而且具有丰富的药用价值，龙眼中所含丰富的次生代谢产物具有丰富的功能。目前我国对龙眼胚性愈伤组织生产次生代谢产物的报道还很少，所以了解龙眼胚性愈伤组织的次生代谢工程和代谢调控非常有意义，该试验研究了不同光周期对龙眼胚性愈伤组织类黄酮和类胡萝卜素积累的影响，对细胞保护酶活性的影响以及对相关合成基因表达的影响，旨在为研究光周期对龙眼胚性愈伤组织生产类黄酮和类胡萝卜素提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

赖钟雄1994 年诱导并由福建农林大学园艺植物生物工程研究所长期继代保存的龙眼松散型胚性愈伤组织（‘红核子’品种LC2 细胞系）[2-4]。

1.2 方法

1.2.1 培养条件。选择在AgNO3培养基上生长状况良好并相同的松散型龙眼胚性愈伤组织接种到2，4-D培养基上，分别在全光照24 h/0 h L/D、长光照18 h/6 h L/D、半光照12 h/12 h L/D、短光照6 h/18 h L/D、全黑暗0 h/24 h L/D 5 种光周期下（25±2）℃处理20 d，其培养条件为：光照培养箱白光，光强为36 μmol/m2·s。

1.2.2 提取与检测方法。将不同光周期处理的龙眼胚性愈伤组织分别于50℃烘箱中烘干至恒重，研钵研磨成粉末状，过40 目筛，于-20℃保存备用。类黄酮采用超声波—乙醇提取的方法，参考董慧雪[5]的方法，并根据实际情况适当加以改动。类胡萝卜素采用酸热法提取，参照张志军[6]的测定方法，并根据崔彤彤[7]优化后的结果稍作改动进行提取测定。

将不同光周期处理后的龙眼胚性愈伤组织分别取适量于液氮中速冻，后转移到-80℃中保存。龙眼胚性愈伤组织中细胞保护酶SOD、POD、H2O2、脯氨酸（PRO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性及含量均按照相应试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）的提取方法和计算方法进行。

针对光周期处理的龙眼胚性愈伤组织采用TriPure 试剂盒（Invitrogen）进行总RNA 提取，并于-80℃保存备用，采用SYBR ExScriptTM（Takara，日本）进行逆转录，逆转录产物保存于-20℃，以用于实时荧光定量PCR 分析。

以cDNA10×稀释液为模板进行扩增，于罗氏LightCycler 480 仪器中进行qRT-PCR 检测。采用SYBR premix Ex TaqTMⅡkit（TaKaRa）进行qRT-PCR，反应体系为20 μL，应用2x SYBR 10 μL，cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。程序为：95℃预变性30 s，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，40 次循环。以EF-1a 为内参基因，利用2-ΔΔCT方法来计算基因的相对表达量。每个取样点设3 个技术重复，试验共设3 次生物学重复。

2 结果与分析

2.1 对类黄酮类与胡萝卜素含量和产量的影响

2.1.1 类黄酮含量和产量。如图1 所示，通过数据统计分析绘制出芦丁标准曲线，得到回归方程式为y=9.1714x+0.0047，其相关系数R2=0.9993，该回归方程可用于样品类黄酮含量的计算。

不同光周期对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮的含量和产量的影响如图2 和图3 所示。其中6 h 光照处理下龙眼胚性愈伤组织中类黄酮的含量和产量均为最高，分别是3.760 mg/g（DW 干重）和0.2457 mg/瓶（DW 干重），且含量和产量均与0、12、18、24 h 光照处理下差异显著；在24 h 光照处理下类黄酮的含量和产量均最低，仅为1.800 mg/g（DW 干重）和0.1175 mg/瓶（DW 干重）。不同光周期处理对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量和产量影响的高低顺序如下：6 h＞12 h＞18 h＞0 h＞24 h。

2.1.2 类胡萝卜素含量和产量。不同光周期处理对龙眼胚性愈伤组织中类胡萝卜素含量和产量的影响如图4 和图5 所示。其中光照24 h 的处理下龙眼胚性愈伤组织中类胡萝卜素含量和产量最高，分别为51.25 μg/g（DW 干重）和3.2697 μg/瓶（DW 干重），且含量与0、6、12、18 h 差异显著，产量与12 h 差异显著；12 h 光照处理下的类胡萝卜素含量和产量均最低，仅为41.25 μg/g（DW 干重）和2.7772 μg/瓶（DW 干重）。不同光周期处理对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量和产量影响的高低顺序为：24 h＞0 h＞6 h＞18 h＞12 h。

2.2 对细胞保护酶活性的影响

2.2.1 SOD 酶。SOD 是植物抗氧化系统中重要的一员，是植物体中重要的活性氧清除剂，是清除ROS的第一道防线，又是H2O2主要的生成酶[8]。如图6 所示，在不同光周期下，光照12 h 时SOD 酶活性最高，随着光照时间的增长，SOD 酶活性逐渐降低，但是光照6 h 时SOD 酶活性最低，光照0 h 时SOD 酶活性相较于其他的光周期来说也很低。

2.2.2 POD 酶。细胞壁当中的POD 可以催化NADH或NADPH 氧化产生进一步歧化生成H2O2和O2[9-10]。POD 和CAT 均能够代谢H2O2，然后由酚底物还原形成的自由基聚合形成木质素[11]。如图7 所示，0 h 光照的时候POD 酶活性最高，6～24 h 这4 个阶段POD 酶活性呈倒“V”模式，其中12 h 光照POD酶活性最高，24 h 光照POD 酶活性最低。

2.2.3 H2O2含量。H2O2作为细胞的有氧代谢产物，在植物体遇到胁迫时便大量产生，可以作为信号分子诱导细胞内防御基因的表达来应对外界环境条件的变化[8]。如图8 所示，在不同光周期的变化下，12 h和18 h 的H2O2的含量相同且最高，而6 h 时H2O2的含量最低。

2.2.4 PRO 含量。PRO 是植物体内最为重要的渗透调节物质之一[12]，在胁迫条件下，植物体内所积累的脯氨酸具有清除胞内活性氧的作用[13]，还能够作为储能物质存储参与细胞内的能量代谢，保证植物体在胁迫条件下的能量供给[14]。如图9 所示，0～24 h 这5 个阶段PRO 含量的变化呈现“V”字形，其中12 h 光照PRO含量最低，随着光照时间的延长（或降低），POD 酶活性呈逐渐上升的趋势，24 h 光照PRO 含量最高。

2.2.5 PAL 酶活性。PAL 广泛存在于植物体当中，是苯丙烷类代谢途径的第一种酶[15]，是许多次级代谢产物的直接或者间接前体[16]。PAL在植物体生长发育和适应外界环境因素过程中起重要作用。如图10 所示，0～24 h 这5 个阶段PAL 酶活性的变化呈现“M”字形，其中6 h 时PAL 酶活性值最大，为17.47 U/g，12 h时PAL 酶活性值最低，为15.11 U/g。

图1 芦丁标准曲线

图2 不同光周期对龙眼EC 中类黄酮含量的影响

图3 不同光周期对龙眼EC 中类黄酮产量的影响

图4 不同光周期处理对龙眼EC 中类胡萝卜素含量的影响

图5 不同光周期处理对龙眼EC 中类胡萝卜素产量的影响

图6 光周期对龙眼EC 中SOD 酶活性的影响

图7 光周期对龙眼EC 中POD 酶活性的影响

图8 光周期对龙眼EC 中H2O2 含量的影响

图9 光周期对龙眼EC 中PRO 含量的影响

2.3 对类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因表达分析

2.3.1 类黄酮合成相关基因表达。如图11 所示，CHI在6 h 时的表达量最高，CHS、DFR 和F3H 均是在18 h 时表达量最高，由此可见18 h 的光照时间可明显促进这3 个基因在龙眼EC 中的表达。

图10 光周期对龙眼EC 中PAL 酶活性的影响

如图11-A所示，随着光照时间的增加，CHI 的表达量呈先上升后下降的趋势，6 h 光照促进了龙眼EC 中CHI 基因的表达，而24 h 光照则明显抑制了CHI 基因的表达，6 h 光照的表达量是24 h光照的表达量的7.69 倍。

如图11-B 所示，随着光周期的变化，龙眼胚性愈伤组织中CHS 基因的表达量呈先上升后下降再上升后下降的趋势，其中18 h 处理下的表达量最高，12 h 的表达量最低，18 h 的表达量是12 h 的6.27 倍，其表达量差异显著。

如图11-C 所示，随着光周期的变化，龙眼胚性愈伤组织中DFR基因的表达量呈现先上升后下降的表达趋势，其中18 h 的表达量最高，0 h 的表达量最低，18 h 的表达量是0 h 的5.54 倍。

如图11-D 所示，随着光照时间的增加，龙眼EC 中F3H 的表达量呈现先上升后增加的趋势，其中18 h 光照明显促进F3H 在龙眼EC中的表达，其表达量是最低0 h 时表达量的9.98 倍。

2.3.2 类胡萝卜素合成相关基因表达。如图12-A 所示，随着光周期的变化，龙眼EC 中GGPS 基因的表达量呈先上升后下降再上升下降的变化趋势，在6 h 光照时其表达量显著高于其他光周期处理下GGPS 的表达量，是12 h 时最低表达量的2.46 倍。

如图12-B 所示，随着光周期的变化，龙眼EC 中PSY 基因的表达量呈先下降后平稳上升再下降的表达趋势，在0 h 光照的黑暗处理时其表达量最高，在24 h 全光照的处理下其表达量最低，最高表达量是最低表达量的1.65 倍。

如图12-C 所示，随着光照时间的增加，龙眼EC中PDS 的表达量呈先下降后上升再下降的趋势，在12 h 光照时达到最高表达量，是24 h 时最低表达量的1.72 倍。

如图12-D 所示，随着光照时间的增加，龙眼EC 中ZDS 的表达量呈先下降后上升的趋势，其中0 h 光照的黑暗处理时其表达量最高，12 h 半光照时其表达量最低，最高表达量是最低表达量的1.53 倍。

3 结论与讨论

图11 光周期对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮合成相关基因表达的影响

图12 光周期对龙眼胚性愈伤组织中类胡萝卜素合成相关基因表达的影响

通过该试验得知，光周期影响龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素的积累，其中光照能够提高龙眼胚性愈伤组织中类黄酮的含量，短光照能够明显提高类黄酮的含量。王伟[17]等研究表明，不同光周期的补光处理使得金线莲总黄酮含量显著高于对照组正常光处理，该试验结果与王伟的试验结果一致。但是该试验中24 h 全光照类胡萝卜素含量最高，而其他3 个光周期处理中类胡萝卜素的含量却比黑暗环境中低，这说明只有足够的光照才能够提高类胡萝卜素含量。通过不同光周期的处理，龙眼胚性愈伤组织中SOD、POD、H2O2的变化一致，SOD 和POD 都是植物氧化应激防御系统中重要的抗氧化酶，共同清除活性氧（ROS），从而维持植物体内自由基的平衡，防止对细胞膜系统造成伤害，从而保持组织的正常代谢。PRO 在6、12、18 h 的PRO含量均低于黑暗时期，24 h 全光照处理的龙眼胚性愈伤组织中PRO 含量比黑暗时期高。PAL 参与形成植物体内类黄酮等次生代谢物质，并且其活性与类黄酮含量显著相关，这也与类黄酮含量在短光照6 h 是龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量最高的结果一致。

通过该研究发现，不同光周期的处理对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮合成基因具有调控作用，其中CHI基因在短光照6 h 时的表达量明显上调，CHS、DFR和F3H均是在18 h 时表达量最高，由此可见长光照18 h 时可明显促进这3 个基因在龙眼EC 中的表达。通过对比发现，24 h 全光照时相比于长光照18 h 时表达量均有不同程度的下调，则可以说明24 h全光照在不同程度上抑制龙眼EC 中类黄酮合成相关基因的表达，由此可见24 h 全光照肯定不是龙眼EC 生产类黄酮的最佳光周期，这个结果也与该研究结果相符。不同光周期处理对龙眼胚性愈伤组织中类胡萝卜素合成基因具有调控作用。其中，GGPS的表达量在6 h 光照时明显上调；PSY的表达量在CK黑暗时期的表达量最高，这说明光周期明显抑制PSY的表达；PDS的表达量在12 h 光照时最高，这说明合适的半光照促进了PDS的表达，其他的光周期则抑制其表达；ZDS的表达量在CK黑暗时期最高，光周期明显抑制其表达。

通过以上试验，初步得到了光周期对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素的积累以及相关基因表达的变化，为龙眼胚性愈伤组织的次生代谢工程和代谢调控研究提了供理论依据。