手术结合化学单侧迷路切除术建立急性前庭损伤小鼠模型

王颖怡 解龙昌 陈文勇 陈伟杰 陈盛强 袁忠民 崔勇

1 广东省人民医院（广东省医学科学院）耳鼻咽喉科（广州510080）2 广州医科大学附属第二医院（广州510260）3 广东省中医院耳鼻喉科（广州510120）4 广州中医药大学（广州510000）5广州医科大学（广州510000）

单侧迷路切除术（Unilateral Labyrinthectomy,UL），同时配合化学迷路切除，作为一种可靠的外周前庭损伤模型的方法，已经在急性前庭损伤动物模型的建立中被广泛应用。

关于急性前庭损伤动物的建模方法，目前分为单纯手术模型及手术配合化学模型这两种。其中手术模型包括从颈部腹侧入路、耳前入路，从而机械性破坏膜迷路的单侧迷路切除术。颈侧入路利于暴露术野，但容易伤及颈部大血管，从而引起动物出血致死。而耳前入路避开了颈部大血管，较为安全，但该入路较难暴露术野，具有一定操作难度。跟化学配合手术方法相比，单纯的手术方法仅仅在视觉上破坏了前庭终器，特别是在器械无法到达的位置，仍可能存在残留的神经上皮。因此，手术配合化学的建模方式能够在手术破坏后，通过化学溶剂来保证残存的神经上皮的破坏。

目前，急性前庭损伤的动物模型以大鼠模型为主，国内暂无急性前庭损伤小鼠模型的报道，而国际上也鲜有该方面的报道。分析原因可能是小鼠的单侧前庭切除在操作上较为困难。但是，小鼠模型的建立有其必要性：跟大鼠相比，小鼠的总体研究成本较低，故利于研究的开展；其次，小鼠的行为学测试易于操作，故利于建模后继续进行前庭代偿的训练和相关研究；最后，利于日后使用定制的基因敲除小鼠以进一步研究其疾病机制及基因功能。因此，在本研究中我们探讨使用手术配合化学切除的方法来建立急性前庭损伤小鼠模型，并对该模型进行评估。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取健康成年雄性C57BL/6J 小鼠（20～30g）共21 只，均由南方医科大学实验动物中心提供。将小鼠随机分为单侧迷路切除术组(n=15)及假手术组(n=6)两组。

1.2 手术准备

所有小鼠均在术前禁饮禁食6小时。在6小时的禁饮禁食后，使用异氟烷气体麻醉小鼠，再给小鼠的眼睛涂上红霉素软膏并贴上贴膜以保护眼睛。剃除小鼠耳周毛发，在术口局部注射0.02 ml的利多卡因注射液以局部浸润麻醉，腹腔内注射0.7 ml的生理盐水以防止小鼠出现脱水。

1.3 手术过程

在显微镜下，对单侧迷路切除术组的小鼠进行小鼠左耳的单侧迷路切除术。手术选择耳前切口，切开后使用镊子进行钝性分离，操作时注意保护面神经及血管。渗血时，使用明胶海绵按压止血。使用精细的钩针钩除鼓膜，再钩除锤骨、砧骨，此时可见镫骨及穿过镫骨前后弓之间的镫骨动脉。以手持单极电凝器对此动脉的两端进行电凝。用精细的钩针勾除镫骨，打开镫骨底板，暴露前庭池，将直角钩针扩大卵圆窗边缘骨质以扩大暴露前庭池，轻轻地勾除骨壁。用吸引器吸除内淋巴液，寻找椭圆囊及球囊斑并以精细钩针去除。寻找半规管的位置，通过勾针进行机械性的破坏。并使用吸引器的吸力对半规管进行破坏。在上述的机械性破坏后，往前庭内塞入含有无水乙醇的明胶海绵，并进行皮肤的缝合。而对于假手术组的小鼠，选择耳前切口，打开其外耳道，再进行皮肤的缝合。

在术中给所有小鼠腹腔注射0.5ml的生理盐水以补液，术后复苏过程中注意保温。

2 急性前庭损伤动物模型的评估

2.1 行为学观察

单侧迷路切除术后的小鼠在清醒后均开始出现一种特殊的偏斜姿势(图1)，头右偏，行走时向右转圈，身体呈筒状翻滚，提尾时出现以身体为轴线的旋转（图2）。术后第二天，症状基本同前。在术后第三天，行走时向右转圈，身体筒状翻滚的体征出现明显的改善。并随着时间推移，以上体征逐渐缓解。在一周后，可观察到小鼠的前庭症状完成初步代偿。但提尾时以身体为轴线的旋转在术后2个月时依然存在。而假手术组小鼠在清醒后并无前庭损伤的症状出现。

图1 单侧迷路切除术后的小鼠出现的偏斜姿势：头右偏，行走时向右转圈Fig. 1 The mouse underwent UL showed a deviated posture,including head tilt and the tendency of body circle towards the operated ear

图2 单侧迷路切除术后的小鼠开始出现提尾后的以身体为轴线的快速旋转Fig. 2 The mouse underwent UL showed rapid body spin on its body's axis

2.2 行为学检测

两组小鼠均在术后第10天接受爬杆试验及平衡木试验。在爬杆试验（Pole test）中，小鼠头朝下地被放置于木杆的顶部，测量其从顶部至底部所需时间。在平衡木试验（Beam-crossing test），小鼠被放在平衡木的起点，允许其探索仪器1 分钟，然后开始记录其通过平衡木的时间，根据其通过平衡木的时间以评分：0-5 秒，1 分；6-10 秒，2 分；11-15秒，3分；16-20秒，4分；21-25秒，5分；＞25秒，6分；掉落10 分。使用SPSS25.0 进行统计分析，结果显示：在爬杆试验中，手术组(n=15)、假手术组(n=6)平均值分别为10.60±2.29、5.83±0.98；平衡木试验中，得分平均值分别为3.80±2.08、1.83±0.41；两组之间爬杆试验（P=0.000）及平衡木试验（P=0.002）检测结果均具有统计学差异（表1）。由此可见术后第10天的手术组小鼠虽然在观察下可见前庭症状初步完成代偿，但是其运动协调功能跟假手术组小鼠比较仍较差。该结果提示在术后第10 天，前庭损伤小鼠模型尚未完全完成前庭代偿。

表1 两组小鼠行为学检测结果Table 1 The results of behavioral tests between UL group and sham operated group

3 讨论

前庭系统具有形成姿势、控制动眼神经的作用，并与感觉神经和运动神经密切联系，还有促进高级认知过程的作用，包括空间感知、空间导航、身体呈现、注意力、记忆力、心理意象、甚至社会认知等[1]。平衡功能的维持，需要前庭觉、本体觉、视觉三者相互协调和它们在中枢神经系统的整合，而前庭系统是最为重要的；前庭系统可在不同的运动状态和头部位置时产生相应的位置觉、运动觉，还能调控肌肉和躯体运动，使人体保持相应姿势，维持平衡功能[2]。 目前在国际上，将前庭症状分为四类：眩晕、头晕、前庭-视觉症状及姿势性症状[3]。当人或者动物的一侧前庭外周器官受损时，因其突然丧失前庭功能，会出现眩晕、恶心、呕吐，快相偏向健侧的自发性眼震，并且头向患侧偏斜，站立不稳，向患侧方向倾斜等症状；动物还可出现沿身体纵轴向患侧方向翻滚，被动或固定环形步态等[4]。在急性期，受损侧前庭神经核的神经元的静息电位减少，而对侧前庭神经核的神经元则变得过度活跃，因此受损侧和健侧的前庭神经核之间的静息电位严重不对称，出现了上述的偏斜姿势、眼震等症状[5]。在一些物种中，一些静态症状会在没有外周前庭系统再生的情况下，在一周内出现改善，这种过程被称为前庭代偿[6]，该概念由Bechterew 在1883年首先提出。当外周性前庭功能减退或丧失时，在双侧前庭传入冲动不对称的情况下，中枢神经系统能够逐渐适应，这是一个复杂的神经元和神经化学反应过程[7]。研究显示在一周内双侧前庭内侧核神经元同时出现了静息活动的再平衡[8]。前庭功能受损后的症状包括静态症状和动态症状，即在静止状态或活动状态时出现的症状,前者包括头部及身体倾斜、反向偏斜、自发性眼震、眩晕等；后者包括前庭-眼反射的增益下降及相位不齐、受损侧前庭-眼反射的时间常数缩小、在挑战性环境下的平衡能力下降等[9]。而静态和动态反射的前庭代偿时间进程是不同的：静态症状一般在一周内恢复，而动态症状趋于在几个月后才恢复正常[10]。

单侧急性前庭损伤后的前庭代偿，是一个复杂、多因素的过程，涉及大脑多个区域的突触和神经元可塑性。可塑性决定了行为恢复的速率和程度，找出可塑性的关键部位是一个巨大的挑战。它包括了具有加工前庭信号作用的成年中枢神经系统的广泛区域，如前庭神经核，小脑，下橄榄核[11]。现今，急性前庭损伤动物模型被用作损伤后中枢神经系统可塑性研究的一个适合的模型。只有建立稳定、有效的相关动物模型，才能进一步研究前庭损伤后中枢神经系统的可塑性机制，并能研究促进其可塑性的方法。

本小鼠模型使用手术配合化学单侧迷路切除术以建立，能够真实地模拟前庭损伤的病理情况，因此可以作为研究前庭损伤后自发出现的前庭代偿机制以及损伤后康复的治疗方法的有效工具。目前，前庭代偿的动物模型多为大鼠，国际上亦极少有前庭代偿小鼠模型的研究。探究其原因可能是小鼠的内耳结构精小，操作上存在一定困难。但小鼠模型具有明显优势，其基因数量、染色体结构均与人类相似，所以其生理、生化指标及其调控机制和人类相同或相似，故可以从小鼠中获得较为可靠的数据；小鼠繁殖能力强，生殖周期短，能极大地节省研究成本及研究时间；其体积小，方便在有限空间内大量饲养，利于进行关于前庭代偿的大规模实验；在对小鼠进行实验时易于抓取，尤其是在进行行为学测试、康复训练中，较容易操作，因此可通过小鼠模型获得有关潜在治疗药物及康复训练的疗效评估；跟大鼠相比，基因修饰小鼠模型价格较为低廉。若建立该小鼠模型，日后还能结合基因敲除小鼠进行疾病机制、基因作用的相关研究。

本文所述的建模方法使用耳前切口行单侧迷路切除术，在机械破坏后，往前庭内塞入含有无水乙醇的明胶海绵。本方法稳定、有效，造模成功率高，具有以下优势：在术前对小鼠进行禁饮禁食，避免了麻醉后出现误吸的可能；使用了气体麻醉配合局部麻醉的方法，减少全身麻醉药物的用量，减少小鼠在麻醉后出现的不良反应；在显微镜下进行精细的操作，可以精细地去除前庭组织，该方法在直视下进行，较为准确可靠；使用了手术配合化学的方法，能够充分破坏前庭神经上皮；术中使用了精细的单极电凝处理镫骨动脉，避免术中出血致死及血污影响术野的情况发生。笔者认为，在进行急性前庭损伤动物模型的建立时，应该注意以下方面：1.精细操作，避免损伤血管、神经，渗血时使用明胶海绵压迫止血，使用电凝笔处理镫骨动脉，避免小鼠因出血而致死；2.操作时充分暴露术腔，熟悉解剖结构，仔细操作，以保证对前庭损伤完成精确的定量，以建立可量化损伤程度的动物模型；3.小鼠术前曾禁饮禁食，且术中可能会有少量出血，而术后清醒的小鼠出现前庭功能丧失的剧烈症状，短时间内难以进食进饮，故术前、术后应进行适量的补液，以避免小鼠出现脱水。

在小鼠复苏后，通过对其进行为学观察及行为学测试以判断其前庭症状的程度。通过观察发现，所有的单侧迷路切除术的小鼠均出现一种特殊的偏斜姿势，即头右偏，行走时向右转圈，身体呈筒状翻滚，提尾时出现以身体为轴线的旋转。随着时间推移，以上体征逐渐缓解。在术后一周时，可观察到小鼠的行走时转圈，筒状翻滚的静态症状明显缓解。通过对前庭脊髓系统的平衡功能进行观察，例如偏斜姿势、失衡行为等症状的动态观察，可对前庭代偿的动态过程进行一定评估[12]。在术后10 天时，对单侧迷路切除术小鼠进行评估其平衡、运动协调功能的行为学检测，结果提示与假手术组相比，单侧迷路切除术小鼠的小鼠存在较差的表现，这可能是与动态症状尚未恢复正常有关。而提尾时出现以身体为轴线旋转的体征，在其术后2个月仍然存在。

如今，急性前庭损伤后的前庭代偿的机制及促进其代偿的治疗方法仍是一个有待解决的问题。本文所述的急性前庭损伤动物模型稳定、有效、成功率高，能以此为基础进一步探究以上问题。