α细辛醚对耐药性癫痫模型大鼠脑组织中P糖蛋白与多药耐药基因表达的影响

袁斯远，王潇慧，孙江燕，刘金民

癫痫是由多种病因引起的慢性脑部疾患，以脑部神经元过度放电所致的突然、反复和短暂的中枢神经系统功能失常为特征的一种疾病。全世界目前大约有7 000万人罹患癫痫，我国大约有900万癫痫病人[1-2]。随着第3代抗癫痫药物(anti-epileptic drugs，AEDs)投入临床使用，临床上目前约有30种AEDs，但约有30%的病人为耐药性癫痫[3]。2010年国际抗癫痫联盟对耐药性癫痫的定义达成共识，一是AEDs治疗的结局分类：临床无发作、治疗失败及不确定；二是在治疗失败的基础上提出了耐药性癫痫的核心定义：两种正确选择、可耐受的AEDs，经足够疗程及剂量药物治疗(单药或联合用药)仍未能控制发作的癫痫[4]。耐药性癫痫的主要特征是癫痫病人对多种AEDs产生了不同程度的耐药性，从而降低了AEDs疗效。因此，逆转耐药、增敏AEDs是改善耐药性癫痫疗效的重要突破口。

针对癫痫耐药性发病机制目前存在6种假说[5]。其中1995年美国学者Tishler 提出的多药转运体假说，20余年来受到学术界广泛关注。该假说认为癫痫的反复发作或长时间的服用抗癫痫药物能够引起癫痫病人血脑屏障中多药耐药基因1a(Multidrug resistance gene 1 a，Mdr1a)mRNA与其编码P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)高表达，高表达的P-gp能够通过水解三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)获取能量将AEDs逆浓度梯度外排出脑组织，从而降低脑组织中AEDs的浓度，进而引起癫痫耐药性[6]。因此，脑组织中Mdr1a mRNA与 P-gp的高表达是产生癫痫耐药的主要机制之一。

课题组前期动物实验研究发现中药复方柴贝止痫汤(柴胡、浙贝母、法半夏、天麻、石菖蒲、地龙、牡蛎)能够下调难治性癫痫大鼠模型海马与皮层中高表达的P-gp 与Mdr1a mRNA[7-9]。依据现代生物方剂分析药理研究策略的指导，使用LC-MS技术对柴贝止痫汤成分血浆动力学浓度进行了检测，发现α细辛醚为柴贝止痫汤主要吸收入血效用成分之一，推测α细辛醚可能是柴贝止痫汤药效物质基础之一[10-11]。α细辛醚为中药石菖蒲主要挥发油成分之一，石菖蒲芳香开窍，为中医脑病临床常用的引经药。在中医“芳香开窍”的理论指导下，有学者发现石菖蒲、石菖蒲挥发油组分以及α细辛醚皆能够下调耐药性细胞系Caco-2上P-gp与Mdr1a mRNA的表达[12-13]。基于以上研究背景，本研究通过反复腹腔注射戊四氮(pentamethazol，PTZ)所致耐药性癫痫大鼠模型，观察α细辛醚对耐药性癫痫大鼠模型海马与皮层中P-gp与Mdr1a mRNA表达的影响，为中医药扭转P-gp介导的耐药性癫痫提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 动物 8周龄SPF级Wistar大鼠购于北京华阜康生物科技股份有限公司[实验动物饲养许可证号：SCXK(京)2014-0004]，饲养于北京中医药大学东方医院实验动物中心SPF级动物室。

1.2 药品 α细辛醚与戊四氮购于上海源叶生物科技有限公司，卡马西平与苯妥英钠购于北京诺华制药有限公司。

1.3 试剂 P-gp 抗体(ab3366，Abcam)，辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠二抗(MD2142，北京百奥思科生物医学技术有限公司)，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(MD2141，北京百奥思科生物医学技术有限公司)，SuperScript Ⅲ RT 反转录试剂盒(11752050，ABI-invitrogen)，SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus(4472920，ABI-invitrogen)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 造模方法 大鼠适应性喂养1周后，采用腹腔注射戊四氮制造耐药性癫痫大鼠模型。

1.4.1.1 癫痫大鼠模型 隔日腹腔注射戊四氮(30 mg/kg)，共注射15次，造模期间观察大鼠癫痫发作情况。按Racine分级标准将大鼠癫痫发作分为5级，Ⅰ级：咀嚼、眨眼、立须等面部肌肉的抽搐；Ⅱ级：以点头运动为主的颈部肌肉抽搐；Ⅲ级：单侧前肢阵挛、抽搐；Ⅳ级：双侧前肢阵挛、抽搐伴身体立起；Ⅴ级：双侧后肢强直，身体背曲强直，跌倒伴全身阵挛。连续3次出现Ⅴ级发作者为癫痫造模成功。

1.4.1.2 耐药性癫痫大鼠模型筛选 将造模成功的癫痫大鼠灌服卡马西平(125 mg/kg)与苯妥英钠(62.5 mg/kg)1 h后，腹腔注射戊四氮(30 mg/kg)，观察大鼠癫痫发作级别，连续3次出现Ⅴ级发作者视为耐药性癫痫大鼠，耐药性癫痫大鼠模型筛选实验持续7 d。

1.4.2 分组及给药方法 将24只造模成功的耐药性癫痫模型大鼠随机分为α细辛醚低剂量组(低剂量组)、α细辛醚高剂量组(高剂量组)与模型组，每组8只，另选8只大鼠为正常组。实验动物自由进食、饮水。α细辛醚低、高剂量组分别给予25 mg/kg和50 mg/kg α细辛醚灌胃；正常组与模型组给予等量生理盐水灌胃。共持续给药3周，3周后取材，摘取大鼠海马与皮层组织进行指标检测。

1.5 检测指标

1.5.1 Western Blot检测P-gp的表达 将大鼠海马与皮层组织匀浆，提取蛋白，应用BCA 试剂盒定量蛋白浓度。分离胶浓度5%，调节样本蛋白浓度为5 μg/μL，180 V电泳15 min，100 V继续电泳1.5 h。297 mA转膜3 h。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜以5%脱脂奶粉封闭 90 min。封闭完成后将PVDF膜依据Marker剪开，分别孵育P-gp一抗(稀释比1∶50)及GAPDH一抗(稀释比1∶500)，4 ℃过夜。洗脱，孵育二抗(两指标二抗稀释比均为1∶2 000)，洗脱，ECL发光，图像采集。

1.5.2 Real time PCR检测Mdr1a mRNA的表达 Trizol试剂提取总RNA。Mdr1a上游引物为5′- GTG AAA GGG GCT ACA GGG TC -3′，下游引物为5′- AGT GTC AAT TGC CAG CCG TA -3′； β-actin上游引物为5′- GTT ACC AGG GCT GCC TTC TC -3′，下游引物为5′- GGG TTT CCC GTT GAT GACC -3′。反应总体积20 μL；qPCR扩增条件：95 ℃ 2 min→94 ℃ 20 s→60 ℃ 20 s→72 ℃ 30 s，共进行40个循环。

2 结 果

2.1 α细辛醚对大鼠海马组织中P-gp表达的影响 经戊四氮反复点燃后，模型组海马组织中P-gp表达量明显高于正常组(P<0.05)。α细辛醚干预3周后，低剂量组、高剂量组海马组织中P-gp表达量均下调，高剂量组与模型组相比海马组织中P-gp表达量下调差异有统计学意义(P<0.05)。详见图1。

与模型组比较，＊P<0.05

2.2 α细辛醚对大鼠皮层组织中P-gp表达的影响 经戊四氮反复点燃后，模型组皮层组织中P-gp表达量明显高于正常组(P<0.05)。α细辛醚干预3周后，低剂量组、高剂量组皮层组织中P-gp表达量均下调，高剂量组与模型组相比皮层组织中P-gp表达量下调明显，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图2。

与模型组比较，＊P<0.05

2.3 α细辛醚对大鼠海马组织中Mdr1a mRNA表达的影响 模型组大鼠海马组织中Mdr1a mRNA表达量较正常组明显升高(P<0.05)。经α细辛醚干预3周后，低剂量组、高剂量组大鼠海马组织中Mdr1a mRNA表达量均降低，其中高剂量组与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组海马组织中Mdr1amRNA表达比较(±s)

与模型组相比，1)P<0.05

2.4 α细辛醚对大鼠皮层组织中Mdr1a mRNA表达的影响 模型组大鼠皮层组织中Mdr1a mRNA表达量较正常组明显升高(P<0.05)。经α细辛醚干预3周后，低剂量组、高剂量组大鼠皮层组织Mdr1a mRNA表达量均降低，其中高剂量组与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠皮层组织中Mdr1amRNA表达比较(±s)

与模型组相比，1)P<0.05

3 讨 论

耐药性癫痫病人最主要的特征是对大部分AEDs 耐药，即使这些 AEDs的作用途径不同。针对癫痫耐药性发病机制目前存在6种假说[5]，其中多药转运体假说受到学术界广泛关注。该假说认为癫痫的反复发作或长时间的服用抗癫痫药物能够引起癫痫病人血脑屏障中Mdr1a mRNA与其编码P-gp高表达，高表达的P-gp能够将AEDs逆浓度梯度外排出脑组织，从而降低脑组织中抗癫痫药物的浓度，进而引起癫痫耐药性[6]。因此，降低脑组织中P-gp与Mdr1a mRNA的高表达为扭转癫痫耐药性的主要途径之一。

课题组前期动物实验研究发现，中药复方柴贝止痫汤(柴胡、浙贝母、法半夏、天麻、石菖蒲、地龙、牡蛎)能够下调难治性癫痫大鼠模型海马与皮层中高表达的P-gp 与Mdr1a mRNA[7-9]。依据现代生物方剂分析药理研究策略的指导，使用LC-MS技术对柴贝止痫汤成分血浆动力学浓度进行检测，发现α细辛醚为柴贝止痫汤主要吸收入血效用成分之一，由此推论α细辛醚可能是柴贝止痫汤药效物质基础之一[10-11]。

α细辛醚为中药石菖蒲挥发油成分之一。19 世纪80年代，从石菖蒲中提取分离出α细辛醚并且推断其为石菖蒲的主要效用成分之一。自此，α细辛醚药理学作用被广泛研究。实验研究显示α细辛醚可用于癫痫、抑郁、焦虑、阿尔茨海默病、帕金森病、失眠以及高血脂等疾病的治疗。并且其广泛的药理学作用主要取决于其多种生物活性，例如抗惊厥、镇静、神经保护、抗氧化、抗炎以及降血脂等[14-18]。

在中医“芳香开窍”的理论指导下，有学者已经发现中药石菖蒲、石菖蒲挥发油组分以及α细辛醚皆能够下调耐药性细胞系Caco-2上P-gp与Mdr1a mRNA的表达[12-13]。本研究以戊四氮反复点燃所致的 P-gp高表达的耐药性癫痫大鼠为研究对象，使用α细辛醚干预3周后，以50 mg/kg剂量α细辛醚干预的大鼠脑组织中P-gp和Mdr1a mRNA的表达量较模型组明显下降。因此，α细辛醚可能扭转P-gp介导的癫痫耐药性，为复方柴贝止痫汤扭转耐药性癫痫的药理学基础；有关α细辛醚下调P-gp的确切机制则需要进一步探究。