基于网络药理学研究黄连治疗心房颤动的活性成分及作用机制

蔡 芸，信琪琪，高 群，贾文浩，靳嘉麟，董 菲，丛伟红，林 谦

心房颤动(atrial fibrillation，AF)是临床最常见的心律失常之一[1]，其患病率和发病率都在持续升高，严重影响病人的生存质量。心房基质重构和电重构是心房颤动发生和维持的关键病理机制[2]。心房颤动属中医“心悸”范畴，痰热扰心证已成为心房颤动病人的常见证候之一[3]。黄连源于《神农本草经》，其味苦，性寒，具有清热燥湿、泻火解毒的功效[4]，针对心房颤动痰热扰心的病机，现代医家多加用黄连以发挥清心降火功效，往往可以取得较好的效果，但其作用机制尚不明确。

网络药理学是基于系统生物学的理论，运用专业网络分析软件，通过构建“药物-靶点-疾病”的网络，分析其协同关系的新学科。其强调中药对疾病的多成分、多靶点、多途径调节作用，从网络层面阐释中药治疗疾病的作用机制[5]，目前已广泛应用到新药开发、多靶点治疗药物等方面[6]。中药多具有多成分、多靶点、多通路的特征，因此本研究拟通过网络药理学的方法，分析、预测黄连治疗心房颤动的药效基础、作用靶点，为从分子水平、细胞水平和基因水平阐明黄连的作用机制提供参考依据。

1 方 法

1.1 黄连成分潜在靶点网络构建 从TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Data-base and Analysis Platform)数据库中检索黄连所有成分及靶点，通过口服生物利用度(OB)、药物相似性(DL)进行活性成分筛选，阈值设定为OB>30%、DL>0.18，Uniprot数据库进行蛋白基因名的转换，再通过Cytoscape3.2.1软件对成分、潜在靶点进行可视化网络构建，利用Bisogenet插件构建成分靶点蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interactions，PPI)网络。

1.2 心房颤动疾病靶点网络构建 以“atrial fibrillation”为关键词分别检索TTD、DrugBank、美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库，获得疾病靶点，通过NCBI数据库进行蛋白基因名的转换，再通过Cytoscape3.2.1软件进行疾病靶点可视化构建，利用Bisogenet插件构建疾病靶点PPI网络。

1.3 药物活性成分-疾病靶点核心网络构建 通过Cytoscape3.2.1软件的Merge功能，将以上构建得到的“成分靶点PPI网络”与“疾病靶点PPI网络”进行Merge分析，得到药物-疾病共同相关的靶点，进一步通过Cytoscape的CytoNCA插件对“成分-靶点-疾病网络”进行拓扑分析，计算出度值，进行核心网络构建与分析。

1.4 基因富集通路可视化分析 利用David数据库将药物-疾病共同相关靶点进行Go注释与KEGG富集通路分析，通过OmicShare平台以高级气泡图进行可视化。

2 结 果

2.1 黄连成分-潜在靶点网络 本研究通过OB、DL参数作为ADME筛选条件，删除冗杂后最终得到11个活性成分、172个潜在靶点，构建得到的可视化网络(见图1)，包含180个节点和260条边；通过Bisogenet插件构建黄连成分靶点PPI网络(见图2)，得到5 887个黄连潜在靶点，共145 163条边。其中对治疗心房颤动可能有作用的黄连活性成分主要包括小檗碱、小檗红碱、表小檗碱、四氢小檗碱、小檗浸碱、黄麻苷A、木兰花碱、巴马汀、槲皮素、黄连碱、甲基黄连碱等(见表1)。

黄色代表黄连成分，红色代表靶点

编号 CAS号 名称OB(%)DLMOL001454633-66-9/2086-83-1berberine(小檗碱)36.860.78MOL00289415401-69-1/17388-19-1berberrubine(小檗红碱)35.740.73MOL0028971816598epiberberine(表小檗碱)43.090.78MOL002903522-97-4(R)-Canadine(四氢小檗碱)55.370.77MOL002904549-21-3Berlambine(小檗浸碱)36.680.82MOL002907N/ACorchoroside A_qt(黄麻苷A)104.95 0.78MOL00062292618-98-9Magnograndiolide(木兰花碱)63.710.19MOL0007853486-67-7/10605-02-4palmatine(巴马汀)64.600.65MOL00009873123-10-1/74893-81-5/117-39-5quercetin(槲皮素)46.430.28MOL0014583486-66-6/6020-18-4coptisine(黄连碱)30.670.86MOL00266838763-29-0Worenine(甲基黄连碱)45.830.87

2.2 心房颤动疾病-靶点网络 349个疾病靶点通过NCBI数据库转换为标准基因名，构建可视化网络(见图3)及“疾病靶点PPI网络”(见图4)，得到6 414个潜在疾病靶点，共153 752条边。

图3 疾病-靶点网络

图4 疾病-靶点PPI网络

2.3 药物活性成分-疾病靶点核心网络 “成分靶点PPI网络”与“疾病靶点PPI网络”Merge分析后构建的“成分-靶点网络”(见图5)，包括4 517个药物-疾病共同的靶点。进一步通过Cytoscape的CytoNCA插件对“成分-靶点网络”进行拓扑分析，首先计算出Degree值中位数为33，然后筛选出度值大于中位数2倍的节点，为1 098个靶点的网络(见图6)，为增加富集度，继续通过CytoNCA插件对1 098个靶点的网络进行拓扑分析，计算出Degree值中位数为71，然后筛选出度值大于中位数2倍的节点为159个作为核心成分靶点网络节点，最后构建“核心成分-靶点网络”(见图7)，其中包括159个疾病靶点和11个活性成分。

图5 成分-靶点网络

图6 1098个靶点的网络

图7 核心成分-靶点网络

2.4 KEGG富集通路信息 利用David对159个靶点进行GO基因注释，通过高级气泡图进行可视化(见图8)。对159个靶点进行KEGG富集分析，得到20条信号通路(见图9)，横坐标表示富集因子，纵坐标表示通路，圆点颜色代表P值，颜色越鲜艳，则P值越小，基因在此通路上的富集显著性越高；圆点大小表示基因数，越大则富集基因数越多。图8为显著性前20的富集结果，包括基因表达负调控-表观遗传、端粒组织、DNA复制依赖核小体组装、蛋白质异源四聚体、rDNA染色质沉默、基因表达的正调控-表观遗传、细胞蛋白代谢过程、核转录的mRNA分解代谢过程-无意义介导的衰变、SRP依赖的靶向膜共转化蛋白、核小体组装、翻译启动、病毒转录、RNA基因沉默、β-连环蛋白TCF复合物装配、端粒封顶、巨核细胞分化负调控、非同源端接双股断裂修复、翻译、rRNA处理、与DNA复制无关的核小体组装等。基因KEGG通路富集分析(见表2)发现黄连治疗心房颤动主要通过酒精中毒、核糖体、细胞周期、泛素介导的蛋白质水解、甲状腺激素信号通路、拼接体、雌激素信号通路、Epstein-Barr病毒感染、PI3K-Akt信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、DNA复制、内质网蛋白质加工、粘合连接、核苷酸切除修复、Notch信号通路、抗原处理和呈现、卵母细胞减数分裂、结节样受体信号通路、非同源末端连接等方面干预心房颤动。每条通路涉及的基因见表3。

图8 159个成分靶点GO注释生物过程气泡图

图9 159个成分靶点富集通路气泡图

编号 通路名称基因数百分比(%)hsa05034Alcoholism(酒精中毒)3018.867 924 53hsa03010Ribosome(核糖体)2616.352 201 26hsa04110Cell cycle(细胞周期)1610.062 893 08hsa04120Ubiquitin mediated proteolysis(泛素介导的蛋白质水解)159.433 962 264hsa04919Thyroid hormone signaling pathway(甲状腺激素信号通路)127.547 169 811hsa03040Spliceosome(拼接体)127.547 169 811hsa04915Estrogen signaling pathway(雌激素信号通路)106.289 308 176hsa05169Epstein-Barr virus infection(Epstein-Barr病毒感染)116.918 238 994hsa04151PI3K-Akt signaling pathway(PI3K/-Akt信号通路)1911.94 968 553hsa04010MAPK signaling pathway(MAPK信号通路)159.433 962 264hsa04066HIF-1 signaling pathway(HIF-1信号通路)85.031 446 541hsa03030DNA replication(DNA复制)53.144 654 088hsa04141Protein processing in endoplasmic reticulum(内质网蛋白质加工)106.289 308 176hsa04520Adherens junction(粘合连接)63.773 584 906hsa03420Nucleotide excision repair(核苷酸切除修复)53.144 654 088hsa04330Notch signaling pathway(Notch信号通路)53.144 654 088hsa04612Antigen processing and presentation(抗原处理和呈现)63.773 584 906hsa04114Oocyte meiosis(卵母细胞减数分裂)74.402 515 723hsa04621NOD-like receptor signaling pathway(结节样受体信号通路)53.144 654 088hsa03450Non-homologous end-joining(非同源末端连接)31.886 792 453

表3 20条通路基因信息

3 讨 论

我国2019年中国心血管病报告提出，中国≥35岁居民的心房颤动患病率为0.71%，极大地危害病人的健康[7]。目前，心房颤动的西医治疗方法可分为“节律控制”“室率控制”，主要干预手段为抗心律失常药物和射频消融术[8]，但存在抗心律失常药物药理机制复杂、远期致心律失常作用、手术需严格适应证等不足[9]。心房基质重构和电重构是心房颤动发生和维持的关键病理机制，心房纤维化是心房基质重构的重要表现形式，心房纤维化或炎症等病理学改变导致的心房扩张，会加重心房纤维化的进程进一步诱发心房颤动，同时，心房纤维化和心房扩张也能导致心房电功能的改变，造成恶性循环[2]。心房颤动已成为心血管领域防治的重点和难点，开发新的有效治疗措施具有重要意义。

心房颤动临床多以心慌为主症，属中医“心悸”范畴，其基本病机不外虚实两个方面，虚者为气血阴阳亏损，心神失养所致；实者则多由痰热、水饮、瘀血等实邪所致[10]。随着现代生活水平的提高，饮食结构的调整，肥甘厚味极易伤及脾胃，以致脾失健运，痰湿内生，郁而化热，痰热内扰，心神不安，而致心悸，表现为心慌间断发作、胸闷、口苦、烦躁失眠等症状[11]。针对心房颤动痰热扰心的病机，现代医家多加用黄连以发挥清心降火功效。目前黄连广泛应用于心血管系统疾病治疗，特别是在防治快速性心律失常方面。既往临床研究证实，含黄连方剂可有效改善快速型心律失常疾病症状，防止疾病的进展[12-16]。课题组前期临床实践表明，含黄连方剂参连复脉颗粒具有益气活血、清心化痰、安神复脉功效，其中黄连苦寒入心经，为臣药，具有清心降火、安神止悸之功[17]。现代药理研究表明，黄连中多种活性成分具有抗心律失常作用[18]，如小檗碱、巴马汀等[19-22]，机制可能与其延长动作电位时间和有效不应期、改善心肌缺血状态、阻断α-受体、改善炎症状态等多方面有关[23]。

本研究通过网络筛选得到黄连活性成分和心房颤动疾病靶点，分别构建成分和疾病靶点的PPI网络，通过Merge分析，得到药物-疾病共同相关的核心靶点可视化网络并进行富集通路分析，结果显示有11个活性成分可以直接或间接作用于159个靶点，5 106条边，涉及20条疾病通路，其中针对心房颤动有效的黄连活性成分主要包括小檗碱、小檗红碱、巴马汀等，它们可能通过调节基因表达、蛋白代谢、巨核细胞分化等生物过程及PI3K-Akt、MAPK、HIF-1、Notch等信号通路来发挥治疗心房颤动的作用。

中药成分复杂多样，能够作用于多个靶点、多条通路，通过君、臣、佐、使的配伍原则作用于疾病，从而实现中药对机体的整体调控，明确其药效物质及作用机制，将更有利于推进中医药的现代化进程[24]。黄连清心降火、安神止悸，临床用于痰热扰心证的心房颤动，疗效明确。从黄连成分-靶点网络图中可以看出，同一活性成分可作用于不同靶点，不同活性成分也可作用于相同靶点，体现出黄连多成分、多靶点治疗疾病的作用特点，从PPI网络可看出，靶点之间的关联情况复杂，数目众多。由此可见，黄连多成分、多靶点、蛋白靶点之间关联作用的特点，可为解释其异病同治的作用机制提供参考。

本研究通过网络药理学方法分析黄连活性成分及心房颤动靶点之间的关系，发现黄连活性成分小檗碱、小檗红碱等可能通过抑制基因表达、抑制巨核细胞分化、抗蛋白代谢等途径共同发挥抗心房颤动的作用。本研究初步探索和预测了黄连治疗心房颤动的药效物质基础与分子生物学机制，为后续实验研究进一步验证其作用机制提供了依据。