EMT相关蛋白ZEB1、E-cadherin在子宫内膜异位症中的表达及相关性研究

朱虹　卢石韦　邹霞　胡昕　高军

[摘要] 目的 研究鋅指增强子结合蛋白（ZEB1）、E-钙粘附蛋白（E-cadherin）在子宫内膜异位症（Endometriosis EMs，简称内异症）中的表达情况，探索两者在内异症发生发展中的作用。 方法 收集住院手术的内异症手术组织标本80例（包括盆腔外特殊部位的内异症12例，深部内异症10例、卵巢内异症38例，同期在位内膜20例），正常子宫内膜20例作为对照，采用免疫组化SP法检测ZEB1、 E-cadherin蛋白在上述各组标本中的表达，分析ZEB1、E-cadherin在内异症中表达的相关性，探讨两者的表达与内异症临床分期的关系。 结果 （1）ZEB1在所有异位内膜中呈阳性表达的有48例，阳性率为80%，在位内膜阳性表达2例，阳性率为10%;正常内膜中不表达。ZEB1在异位内膜阳性表达显著高于在位内膜和正常内膜（P<0.001）;卵巢型内异症中ZEB1表达与临床分期无明显相关性;（2）E-cadherin在正常内膜中100%表达，异位内膜中表达率呈不同程度的缺失，各组中的表达有显著性差异（P<0.001）;（3）在内异症中ZEB1的表达与E-cadherin的表达呈负相关。 结论 ZEB1在内异症中表达显著升高，并与E-cadherin表达呈负相关，提示ZEB1可能通过抑制E-cadherin的表达，促进上皮间质转化（EMT）的发生，在内异症侵袭转移中发挥重要作用。

[关键词] 子宫内膜异位症;ZEB1;E-cadherin;免疫组织化学

[中图分类号] R711.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）28-0031-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of zinc finger enhancer binding protein （ZEB1） and E-cadherin （E-cadherin） in endometriosis EMs（endometriosis EMs） and their role in the development of endometriosis. Methods 80 patients with endometriosis surgical tissue in our hospital were collected（including 12 cases of endometriosis in special part outside the pelvic cavity， 10 cases of deep endometriosis， 38 cases of ovarian endometriosis， 20 cases of eutopic endometriosis. Twenty cases of normal endometrium were used as controls. The expression of ZEB1 and E-cadherin proteins in the above groups were detected by immunohistochemical SP method. The correlation between ZEB1 and E-cadherin expression in endometriosis was analyzed. The relationship between their expression and clinical stage of endometriosis was explored. Results ①There were 48 cases of ZEB1 positively expressed in all ectopic endometrium， and the positive rate was 80%. There were 2 cases of positive expression of eutopic endometrium， and the positive rate was 10%. ZEB1 was not expressed in normal endometrium. The positive expression of ZEB1 in ectopic endometrium was significantly higher than that in eutopic endometrium and normal endometrium（P<0.001）.There was no significant correlation between ZEB1 expression and clinical stage in ovarian endometriosis.②E-cadherin is 100% expressed in normal endometrium. The expression rate of ectopic endometrium showed different degrees of loss， the expression of each group was significantly different（P<0.001）.③ZEB1 expression was negatively correlated with E-cadherin expression in endometriosis. Conclusion ZEB1 expression is significantly increased in endometriosis and negatively correlated with E-cadherin expression， suggesting that ZEB1 may promote the development of epithelial-mesenchymal transition （EMT） by inhibiting the expression of E-cadherin， which plays an important role.

[Key words] Endometriosis; ZEB1; E-cadherin; Immunohistochemistry

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs，简称内异症）指具有生长功能的子宫内膜腺体和间质种植在子宫腔被覆黏膜以外，在育龄期妇女中发病率可达10%～15%[1]，可导致痛经不孕、盆腔痛及月经改变等症状，严重影响妇女的生活质量。虽然内异症是一种良性疾病，但却有类似恶性肿瘤发生侵袭、转移的特性[2]，因此，研究者们常从恶性肿瘤的发生机制入手，研究内异症的发生发展。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞失去原有的形态、排列极性及细胞间的链接，表面黏附分子发生改变，最终变成具有迁移能力的间质细胞表型，是肿瘤侵袭转移的关键步骤[3-4]。EMT受到多种转录因子的调控，其中，ZEB家族作为EMT的核心转录因子，在多种肿瘤中被证实可以通过抑制E-cadherin的表达，促进EMT的发生[5]。本研究中，我们通过检测ZEB1和E-cadherin蛋白在内异症中的表达情况，研究二者与EMT及内异症侵袭转移的关系，为内异症提供新的诊疗思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究共收集组织标本100例，均来自南昌大学第三附属医院妇科的住院患者，所有标本均经病理证实，其中卵巢型子宫异位内膜囊肿38例（巧克力囊肿），深部内异症（deep infiltrating endometriosis，DIE）的异位内膜组织10例，盆腔外内异症病灶12例，同期的在位内膜20 例，以正常子宫内膜20 例作为对照。盆腔外内异症组标本采集于2010年1月～2018年12月的石蜡标本，异位的部位包括宫颈2例，会阴1例，腹壁9例;38例卵巢异位内膜组标本及10例DIE标本采集于2016年8月～2018年12月收治的内异症患者，年龄24～52岁，平均34.8岁。按照1997年美国生育协会修改的rAFS分期法[6]，Ⅰ期7例、Ⅱ期12例、Ⅲ期8例、Ⅳ期11例;20例卵巢内异症患者在位内膜取自上述因内异症而行子宫切除的子宫在位内膜，或诊刮所得的子宫内膜;正常对照组为同期因子宫肌瘤或输卵管性不孕住院手术诊刮所得的子宫内膜，均排除其他子宫内膜病变。两组的年龄无统计学差异。所有患者术前6个月未用过内分泌药物，6个月内无妊娠和哺乳史，均有完整的临床和病理资料。

1.2 主要试剂

兔抗人ZEB1多克隆抗体（ab87280）、鼠抗人E-cadherin多克隆抗体（ab233766）购自Abcam公司，免疫组化SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

离体新鲜标本取材后置于4%多聚甲醛中固定，脱水，石蜡包埋，每份标本切片3张，厚度为4 μm，盆腔外内异症病例自病理科收集既往病例蜡块重新切片。分别进行HE染色和链霉素抗生素蛋白-过氧化酶法（SP法）免疫组化染色。

免疫组化结果判定指标为细胞浆/细胞膜内棕黄色颗粒状着色即为阳性。结果判断在双盲下进行，每张切片由两名经验丰富的病理科医生分别计数。判定标准采用半定量评分法，结合细胞染色的百分比及染色强度进行判定[7]。染色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3 分;阳性细胞百分比：无阳性细胞为0分，1%～为1分，10%～为2分，50%～为3分，75%～为4分。2项评分乘积≤4为阴性，>4分为阳性。

1.4 统计学处理

应用SPSS23.0软件，计数资料采用百分比（%）表示，组间阳性率比较采用Pearson χ2检验，两两比较采用χ2检验Fisher确切概率法。采用Pearson法进行相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZEB1、E-cadherin蛋白的阳性表达定位

ZEB1蛋白的阳性表达主要见于子宫内膜腺上皮细胞的细胞浆和细胞核，浅黄色或棕黄色颗粒见封三图1～4;E-cadherin蛋白的阳性表达定位于细胞膜和细胞浆，两者在各组中的表达情况见封三图5～8。

2.2 ZEB1蛋白在内异症中的表达情况

在异位内膜中，ZEB1的阳性表达有48例，阳性率为80%，在位内膜中阳性表达有2例，阳性率为10%，为浅黄色颗粒;在正常子宫内膜中无ZEB1的阳性表达见封三图1～4。ZEB1在异位内膜中的阳性表达率显著高于在位内膜和正常内膜，差异有统计学意义（P<0.001）;在DIE和盆腔外异位病灶中的表达与卵巢型内异症相比，差异无统计学意义（P>0.05）;在位内膜和正常内膜中ZEB1表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.3 卵巢内异症中ZEB1蛋白表达与临床分期的关系

Ⅰ～Ⅱ期卵巢内异症异位内膜ZEB1的表达阳性率与Ⅲ～Ⅳ期相比，差异无统计学意义（P>0.05），提示内异症中ZEB1的表达与rAFS临床分期无明显相关性。见表2。

2.4 E-cadherin蛋白在内异症中的表达情况

在异位内膜中，E-cadherin有10例阳性表达，阳性率为16.67%，在位内膜中阳性表达有19例，阳性率为95%;正常内膜的阳性表达率为100%。E-cadherin在异位内膜中的阳性表达率低于在位内膜和正常内膜，差异有统计学意义（P<0.001）;在DIE和盆腔外异位病灶中的表达与卵巢型内异症相比，差异无统计学意义（P>0.05）;在位内膜和正常内膜中E-cadherin表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.5 ZEB1蛋白与E-cadherin蛋白表达的相关性

在异位内膜中，ZEB1表达阳性的病例48例，其中44例E-cadherin表达阴性;ZEB1表达阴性的病例12例，其中6例E-cadherin表达阳性。相关性統计分析结果显示，ZEB1与E-cadherin表达呈负相关（r= -0.447，P<0.001）。见表4。

3 讨论

3.1 内异症中的EMT现象

内异症仍然是临床治疗中的难题之一，严重危害女性的身心健康，其发病机制目前认为完全明了。内异症具有侵袭生长、远处转移、高复发率的特点，因此很多学者认为它是一类与恶性肿瘤类似的疾病。大量研究表明，EMT是上皮性肿瘤侵袭转移的关键步骤[3-4]。EMT的主要过程是上皮细胞失去上皮表型，转变为可自由移动的间质细胞，从而变得更具有侵袭性，甚至可抵抗细胞毒性药物的作用[8]，在这一过程中，维持细胞间黏附和紧密排列的上皮性黏附分子E-cadherin表达缺失，间质分子标记物Vimetin表达升高，从而使上皮细胞间连接松散，失去极性。E-cadherin的下调是EMT的标志性事件[9]。在多种上皮性恶性肿瘤中，可观察到E-cadherin蛋白的下调和Vimetin蛋白的上调[10]。

近年来，EMT在内异症中的研究陆续被报道，如上皮性标记物keratins和E-cadherin的上调，N-cad、Twist、Snail、Vimentin、S100A4、TGF-β等mRNA的下调在内异症中均有报道[11-13]。尽管报道不多，但仍为EMT在内异症中的研究开启了新的篇章。

本研究采用免疫组化方法检测不同部位内异症异位内膜组织中E-cadherin蛋白的表达，发现在异位内膜中，E-cadherin表达不同程度的缺失，盆腔外为16.67%（2/12），DIE为10%（1/10），卵巢型的阳性率为18.42%（7/38），在位内膜的阳性率为95%（19/20），正常内膜为100%，以上结果表明在内异症中确实存在EMT现象，这与Bartley J[11]的结果类似，而在Matsuzaki S[13]的研究中，不但证实了内异症中存在EMT和MET现象，还更加详细地描述了不同部位异位病灶EMT相关蛋白的表达差异：在腹膜黑色病灶中、DIE病灶中，表达比正常内膜、腹膜红色病灶、卵巢型异位病灶增高，并且保持间质细胞标记物（Vimentin、S100A4）的表达，此外DIE病灶中的上皮细胞β-catenin表达要高于腹膜红色、黑色病灶、卵巢型异位病灶，这些结果表明，MET过程更多地发生于DIE病灶中。本研究中，仅有少数的异位内膜的E-cadherin呈现阳性表达，故仍提示在异位病灶中更易出现EMT而导致病灶的侵袭转移。

3.2 ZEB1蛋白在内异症中表达增高，并与EMT相关

EMT过程中重要的转录因子包括Snail家族、ZEB1/ZEB2、Slug、Twist等[5]，其中，ZEB1是肿瘤进展的关键调节因子，ZEB1又称为锌指-含同源框转录调节因子delta-球蛋白增强子，ZEB1介导的信号通路亦是EMT最重要的通路之一[14]。此外，ZEB1可通过其C端结合蛋白（C-terminal binding protein，CTBP）参与抑制E-cadherin基因的表达，进一步促进细胞侵袭转移能力的增强[15]。国内学者张晓军等[16]发现，子宫内膜腺癌中存在EMT现象，miRNA/ZEB1信号通路可对EMT过程中重要的分子标记物产生抑制作用。李晓婷等[17]体外实验中发现，整合素A2（ITGA2）可调控ZEB1表达，促进卵巢癌细胞的侵袭转移，当二者降调后，卵巢癌细胞的侵袭转移作用受到抑制。在宫颈癌的研究中，潘琳[18]发现ZEB1在宫颈癌细胞系均有不同程度的表达，提示ZEB1与宫颈癌的发生发展密切相关。在内异症的研究中，Philip CL等[19]发现子宫内膜间质细胞中ZEB1的表达下调，而在子宫内膜上皮细胞中表达上调，并与TGF-β、BMP2、COX2等形成信号通路激活EMT过程。Furuya M等[20]则发现异位内膜中存在ZEB1的高表达，在正常内膜中不表达，提示ZEB1可通过EMT在内异症进展中发挥重要作用，是一个潜在的转移预测因子。而在Konrad L等[21]的研究中，发现尽管在异位内膜组织中，ZEB1表达明显增加，但上皮性的标记物如K18、K19、MUC1等持续表达，上皮细胞的表型并未丢失，因此EMT可能在内异症中有一部分的作用，但并不是主要的致病因素。

本研究通过检测ZEB1蛋白在不同类型内异症中的表达，分析其与临床分期的关系，初步探讨了ZEB1在内异症EMT及其发生发展、侵袭转移中的作用，结果显示，ZEB1阳性表达定位于细胞浆/细胞核，在异位内膜中的阳性率为80.00%（48/60）（盆腔外83.33%（10/12），DIE 100.00%（10/10），卵巢型73.68%（28/38），在位内膜中表达极低，阳性率为10.00%（2/20），正常内膜中不表达，三者之间相比，差异有统计学意义（P<0.001），在DIE病灶中阳性率最高，这也与临床上DIE病灶症状重、浸润种植病灶深等特征相关。盆腔外的异位病灶阳性率稍低于DIE，分析本組病例中盆腔外病灶以腹壁切口内异症为主，病灶相对较局限，且范围较小，病例数不多，故阳性率表达统计学意义不大。进一步分析ZEB1与E-cadherin的关系，结果显示二者呈负相关（r=-0.447，P<0.001），这个结果与EMT过程中ZEB1抑制E-cadherin的表达机制相吻合。此外，卵巢型内异症与临床分期的相关性分析结果显示，ZEB1蛋白的表达与临床分期并无相关，推测现行的rAFS分期仅考虑病灶大小、深浅、而并未考虑病变的性质有关。在内异症的初期，腹膜病灶主要为红色表浅病灶，但此时腺体和间质结构完整，具备较强的侵袭能力。

综上所述，ZEB1蛋白在内异症异位内膜表达显著升高，以DIE为甚，并与E-cadherin表达呈负相关。提示ZEB1可能通过抑制E-cadherin促进EMT过程，加速病灶的侵袭转移，在内异症的发生发展中起到重要作用。联合检测ZEB1和E-cadherin对内异症的诊断和预后有一定的价值，进一步明确ZEB1诱导的EMT的机制也将有助于为内异症的靶向治疗提供理论依据。

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（收稿日期：2019-07-01）