龙牙百合粉多糖提取工艺优化及其抗氧化

□ 邓 鹏 廖 聪 何 平 尹乐斌 邵阳学院食品与化学工程学院

龙牙百合是百合科百合属中的优质种类，其鳞片肥厚且适度弯曲，鳞片颜色为洁白到宝黄之间，型似龙牙，故称龙牙百合。龙牙百合鳞片营养丰富，含有大量淀粉以及丰富的糖类、生物碱和多酚类物质，具有润肺止咳、宁心安神之效。研究表明，多糖类物质具有降血脂、降血糖和抗氧化之效[1-2]。近年来，龙牙百合产量逐渐上升，关于龙牙百合综合利用的研究也越来越重要，因此本文对龙牙百合粉多糖提取工艺进行优化，并对其ABTS自由基、DPPH自由基清除能力进行研究。

1 材料与仪器

实验仪器主要为VELOCITY-14R离心 机（Dynamica-Scientific-Lid）；UV-1780紫外分光光度计（日本岛津仪器有限公司）；EL204分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；SY-1220恒温水浴槽（南京市畅翔仪器设备有限公司）。

实验材料有龙牙百合粉（邵阳市隆回县提供）；苯酚（成都金山生化试剂有限公司）；浓硫酸：（宁波市星月化玻有限公司）；蒽酮（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法

2.1 标准曲线的绘制

葡萄糖标准溶液的配制：准确称取干燥至恒重的葡萄糖0.1 g，溶解稀释后转移至500 mL容量瓶中，定容。2 mg/mL蒽酮溶液配置：准确称取200 mg蒽酮，溶解于100 mL的浓硫酸之中，转移至棕色容量瓶中，低温贮藏（现配现用）。取6支洁净的具塞刻度试管，分别移取0、0.1、0.2、0.3、0.4 mL与0.5 mL的葡萄糖标准溶液，补充蒸馏水至1 mL，置于冰水浴中，加入2 mg/mL蒽酮溶液4 mL，摇匀，沸水浴10 min，冷却至室温，于620 nm测试吸光度。

2.2 龙牙百合多糖提取方法及提取率计算

取龙牙百合粉2 g，按单因素实验条件提取，提取结束后于4 ℃下，6 000 r/min离心15 min，取0.1 mL离心液加入到100 mL容量瓶中，得龙牙百合多糖提取液，重复3次。

多糖提取率计算如公式（1）。

式（1）中：A为多糖提取率；c为提取液多糖浓度（mg/mL）；V为溶液体积（mL）；m为原料质量（mg）。

2.3 单因素工艺优化

本实验主要从不同料液比、提取温度、提取时间3个方面进行龙牙百合提取多糖的工艺参数优化。

2.3.1 不同料液比对多糖提取的影响

称取龙牙百合粉2 g，将蒸馏水按照料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40与1∶50（g/mL）的比例，加入锥形瓶中，摇匀并放入70 ℃水浴锅中，提取1.5 h，提取3次。

2.3.2 提取温度对多糖提取的影响

称取龙牙百合粉2g，将蒸馏水按料液比1∶30加入锥形瓶中，摇匀并放入50、60、70、80 ℃和90 ℃下的水浴锅中，提取1.5 h，提取3次。

2.3.3 提取时间对多糖提取的影响

称取龙牙百合粉2 g，将蒸馏水按料液比1∶30加入锥形瓶中，摇匀并放入70 ℃的水浴锅中，提取0.5、1.0、1.5、2.0 h以及2.5 h，提取3次。

2.4 正交实验

在单因素试验基础上，选择提取时间、提取温度和不同料液比为变量作为影响因素，多糖提取率作为评价指标，进行正交优化。

2.5 抗氧化性指标测定

为研究龙牙百合总酚的抗氧化活性，本实验将对龙牙百合总酚清除ABTS自由基、DPPH自由基的能力进行研究[3-4]。

2.5.1 ABTS自由基清除率测定

ABTS储备液的配制：将20 mL的7 mmol/L的 ABTS和 352 μL的 140 nmol/L的过硫酸钾混和，于暗处室温下放置12～16h。使用前用无水乙醇稀释成ABTS工作液，并将工作液的温度控制在30 ℃，734 nm波长下的吸光度为（0.7±0.02）。取提取液0.5 mL和1.5 mL无水乙醇加入试管中，以2 mL的无水乙醇作空白对照，加ABTS工作液2 mL静置6 min后，在波长734 nm下测其吸光度，最后按公式（2）计算ABTS自由基清除率。

式（2）中：M1表示ABTS自由基清除率；Ni为提取液吸光值；Nj是对照组的吸光值。

2.5.2 DPPH自由基清除率测定

将 2 mL的 2.0×10－4mol/L的DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）乙醇溶液和2 mL提取液混合，室温下避光静置30 min，以乙醇为对照组，并于517 nm处检测吸光度，DPPH自由基清除率由公式（3）计算。

式（3）中：M2表示DPPH自由基清除率；Nm是提取液的吸光值；Nc是对照组的吸光值；Nk本底吸光值。

3 试验结果与分析

3.1 标准曲线

由Excel拟合实验数据得标准曲线，如图1所示，曲线方程为y=8.104 3x+0.009 6。其中R2=0.998 3，表示该回归曲线可靠。

图1 葡萄糖标准曲线图

图2 料液比对多糖提取率的影响图

图3 提取温度对多糖提取率的影响图

图4 提取时间对多糖提取率的影响图

3.2 单因素实验结果

3.2.1 不同料液比对多糖提取的影响

由图2可得，多糖提取率先上升后下降，这是因为料液比过低时，百合粉不能充分与溶剂接触，接触面积过低，导致多糖溶出量较少。随着料液比的增大，百合粉逐渐充分溶解于溶剂之中，多糖提取量也因此增大，直到1∶40达到极值。随着料液比的继续增大，多糖因分散更容易被分解，以至于料液比1∶50时，提取率开始下降。

3.2.2 提取温度对多糖提取的影响

提取温度对多糖提取的影响如图3所示，从图3可得，随着温度的上升，提取率先升后降，这可能是因为温度过低，水分子不够活跃，导致多糖溶出较低。随着温度的上升，分子运动激烈，从而使得多糖溶出增加，80 ℃时，多糖提取率达到最高值。同时随着温度的上升，多糖的分解速率也在上升，在90 ℃提取，溶出速率与分解速率差值随着提取时间越来越小，直到1.5 h时，分解速度已经大于溶出速率，所以提取率低于80 ℃。

3.2.3 提取时间对多糖提取的影响

如图4所示，提取时间处于0.5～1.5 h时，提取率呈先上升趋势，于1.5 h达到峰值，随后开始下降。这可能是因为提取时间过短，多糖尚未完全溶出，以至于提取不完全，随着提取时间的增加，胞内与胞外多糖浓度渐渐平衡，溶出速率降低，但随着胞外多糖浓度的上升，其分解速率也在上升，在1.5 h之后分解速率占上风，因此多糖提取率呈下降趋势，所以最佳提取时间为1.5 h。

3.3 正交实验优化龙牙百合总酚提取结果

3.3.1 正交实验水平

由单因素结果可得最佳液料比为1∶40、提取温度80 ℃、提取时间为1.5 h，因此设计的正交实验水平如表1所示。

3.3.2 正交实验结果分析

龙牙百合多糖提取工艺优化，以提取时间、提取温度、液料比为因素变量，总酚提取量为衡量指标的正交实验设计，方案及结果见表2所示。由表2得出，3个因素对龙牙百合多糖的提取率的影响为：料液比＞提取温度＞提取时间。龙牙百合提取总酚的最佳工艺条件组合为A1B2C2，即提取时间为1.5 h、提取温度为80 ℃、料液比为1∶40。

表1 正交实验因素水平表

表2 正交实验分析表

3.4 正交实验模型验证结果

根据正交实验结果的最佳工艺参数进行验证实验，多糖平均提取得率6.52%（n=3）。

3.5 抗氧化试验结果

在提取龙牙百合多糖的最佳工艺条件下测定ABTS自由基和DPPH自由基的清除率，结果分别为67.2%与62.4%。

4 结论

正交实验结果表明，各因素对多糖提取率结果的影响程度排序为料液比＞提取温度＞提取时间，在时间为1.5 h、温度为80 ℃、料液比为1∶40时，提取结果最佳。此条件下进行验证实验，结果表明，多糖提取率为6.52%（n=3），具有真实性及较好的稳定性，其ABTS自由基清除率为67.2%，DPPH自由基的清除率为62.4%。优化所得的水提工艺稳定、可行，可用于龙牙百合粉的多糖的提取。