CHFR基因甲基化与消化道肿瘤发生及对化疗药物敏感性的研究新进展

陈苗综述 冯立，邢智审校

肿瘤是目前危害人类健康的主要疾病之一，明确肿瘤的发生机制对于早期诊断和治疗是极其重要的课题。目前，部分肿瘤发现时已处于晚期，因此，人们探索能在肿瘤发生的早期就能被检测出来的标记物。经过大量研究发现CHFR(checkpoint with forkhead-associated and ring finger)蛋白在正常组织中广泛表达，而在癌组织中表达缺失或减少，CHFR基因的缺失最初是在结直肠癌和神经母细胞瘤细胞系中被发现的，然后在食管癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌中也有报道[1-4]。而启动子CpG 岛的甲基化是导致CHFR 基因表达缺失或沉默的重要机制，由此而引发肿瘤的发生。

1 CHFR基因的结构和功能

1.1 CHFR基因的定位和结构 CHFR基因定位在染色体12q24.3，其编码产物为含664个氨基酸的蛋白质，包含一个N-端(forkhead-associated,FHA)结构域，一个中心环指区(ring finger,RF)和一个富含半胱氨酸的C端结构域。环指区域对CHFR泛素化活性非常重要，是含锌的蛋白质折叠，它编码了一个E3泛素酶的家族[5]。在富含半胱氨酸的区域内，RaR-结合锌指(PBZ)位于能够结合聚(APP-核糖)PARP家族成员(如PARP-1)的位置。FHA区是许多转录因子和蛋白激酶结合DNA复制叉的特定区域，许多包含FHA区的蛋白质是细胞周期检查点，CHFR基因同样是一个细胞周期检查点，因此命名为CHFR。CHFR的FHA区能识别并结合磷酸化蛋白质，它在检查点和DNA修复蛋白质中频繁发现[6]。

1.2 CHFR基因的生物学功能

1.2.1 CHFR蛋白是泛素化连接酶: CHFR通过泛素化连接酶的功能影响有丝分裂检查点，该连接酶的作用不是为了降解，而是为了激活信号转导，通过催化形成非经典Lys63-linked聚泛素化链[5]。最近研究发现，CHFR还可以泛素化并调控TOPK的表达[7]。TOPK是一种有丝分裂丝氨酸/苏氨酸激酶，可磷酸化下游底物PTEN并使其失活，从而导致AKT活化。CHFR通过抑制TOPK，抑制了AKT的诱导激活，从而阻断G2/M的进展。

1.2.2 CHFR是细胞周期检查点: CHFR是一种早期有丝分裂检查点基因，也是细胞启动DNA和染色体损伤修复机制的关键，在控制染色体完整性方面起着重要作用[1]。有丝分裂检查点能保证染色体正确的分配给下一代。细胞周期G2/M过渡期对各种应激都很敏感，大多数情况下并不损伤DNA，如当细胞受到放疗、低温、缺氧等刺激时，它们会激活前期检查点，阻止细胞进入有丝分裂。事实上，该过程大部分情况下是可逆的，经过一个适应调节阶段或当应激解除时，有丝分裂又重新开始。细胞短暂地停在G2末期，称为“预前期”，有研究发现,预前期主要是由CHFR为主的途径诱导发生的，CHFR在所有正常组织的细胞质中都有表达，在微管中毒或辐射损伤时在细胞核中积累。在定位到细胞核后，CHFR被PI3K信号通路中的蛋白激酶B(PKB/AKT)磷酸化。在细胞周期的不同阶段，CHFR表达水平波动很大，微管应力将导致CHFR表达水平升高和有丝分裂抑制。相反，由AKT刺激的自氧化还原活性和CHFR降解是进入有丝分裂的先决条件[8]。因此，CHFR也控制着G2/M转变的细胞周期进程。

1.2.3 CHFR是肿瘤抑制因子：Yu等[9]通过建立小鼠敲除模型发现，缺乏CHFR的小鼠易患癌症，发生自发性肿瘤，该结果表明CHFR是一种肿瘤抑制因子，通过控制关键分裂蛋白(如Aurora A)的表达水平来确保染色体的稳定性。此外，最近的一项研究表明，CHFR除了作为肿瘤抑制因子，还在调节促炎性趋化因子白细胞介素-8(IL-8)表达方面具有额外的作用。CHFR能够抑制NF-κB信号通路和引发后来细胞迁移及减少血管生成，失活CHFR触发NF-κB信号活动，从而加速血管生成和转移表型，与不良预后相关[10]。

2 CHFR甲基化与消化道肿瘤发生的关系

2000年Scolnick等[1]发现CHFR基因的表达缺失与肿瘤的发生有关，之后大量的研究对肿瘤中CHFR基因的表达进行了检测,证实了CHFR在肿瘤中的表达缺失，同时发现了CHFR的表达沉默与启动子区CpG岛的甲基化有关。2006年 Morioka等[11]研究发现, 38例原发食管癌肿瘤组织中有9例CHFR基因启动子区异常甲基化，而对应的正常组织没有观察到甲基化现象。之后Mohammed等[12]用定量RT-PCR法检测发现，与正常食管组织相比79%的食管腺癌中CHFR转录物表达下调;免疫组化分析75例食管腺癌样本，有75%的CHFR蛋白表达缺失，甲基化检测发现31%的肿瘤样本CHFR启动子区DNA超甲基化，证明CHFR甲基化在食管癌组织中广泛表达。吴书胜等[13]研究了CHFR在食管癌、食管上皮内瘤变及正常食管组织中蛋白的表达，结果发现92例食管癌组织中CHFR蛋白阳性表达率仅为7.61%，食管上皮内瘤变组织阳性表达率为54.55%，正常食管组织为96.3%；高分化的食管癌组织中蛋白的阳性表达率为33.33%，明显高于中—低分化的食管癌组织CHFR蛋白表达阳性率的1.35%，该研究表明CHFR在食管癌中表达沉默是频发事件，基因启动子区异常甲基化是表达沉默的主要原因，可能与食管癌的发生发展有关，其与食管癌分化程度的关系可能更为密切。在胃癌中，2003年Satoh等[14]就对胃癌的有丝分裂检查点基因CHFR的表观遗传失活进行了研究，发现20%的胃癌细胞系和39%的原发性胃癌的CHFR表达被DNA甲基化抑制。此外，未表达CHFR的细胞表现出检查点功能受损，导致2种微管抑制剂多西他赛和紫杉醇治疗后cyclin B1的核定位。表明了CHFR异常甲基化是预测胃癌对微管抑制剂敏感性的分子标记物。2016年Sepulveda等[15]研究了从非化生的胃黏膜到肠化生，从肠化生到胃癌的DNA样本，结果显示，CHFR在胃癌和非化生黏膜中显著增加了CpG甲基化，并且CHFR基因的CpG甲基化水平在致癌阶段逐渐增加。之后Shi等[16]对13项研究做了Meta分析，其中包括758例胃癌病例和641例对照者，结果表明CHFR的甲基化与胃癌风险的增加有显著相关性，并且发现CHFR甲基化是胃癌的早期表观遗传事件。最近Ding等[17]汇集了15项研究，包括827例胃癌患者，荟萃分析数据显示：在胃癌中，CHFR启动子甲基化的频率高于正常胃组织，并发现CHFR甲基化与淋巴结转移有显著的相关性。在结直肠癌(CRC)中，最新研究表明CHFR启动子甲基化不仅是CRC的诊断生物标记，而且是一个预后标志。Sun等[18]汇集了7项研究包括966例结直肠癌患者，检测癌组织CHFR启动子甲基化的频率与正常结肠黏膜组织相比较，结果表明癌组织中CHFR启动子甲基化的频率显著增加，CHFR启动子超甲基化与淋巴结转移状态也显著相关。另外CHFR启动子超甲基化与CRC患者的整体存活率显著相关。Zhang等[19]在5个胰腺癌细胞系中测量了CHFR表达，在Capan1细胞中过度表达CHFR降低了增殖率，减少了细胞迁移和入侵能力。数据显示，CHFR通过G1期阻滞来调节胰腺癌细胞的细胞周期，同时它也作为一种重要的肿瘤抑制因子在体外发挥作用，然而CHFR的过度表达并不是微管抑制剂引起的细胞凋亡的有利因素。结果表明CHFR作为胰腺癌的肿瘤抑制因子，其在控制胰腺癌细胞周期中有潜在作用。

多项研究表明，CHFR启动子CpG岛甲基化不仅可以在原发性癌症中检测到，在血液(NSCLC)、粪便(CRC)和腹膜液(胃癌)中也可以检测到[20-23]。这为CHFR作为诊断标记物提供了支持。

3 CHFR甲基化与化疗药物敏感性的关系

微管靶向化疗药物如紫杉醇是最广泛使用的一线和二线化疗药物，用于治疗最常见的恶性肿瘤，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌，但对紫杉烷类的一级耐药是常见的，并且是一个重要的临床问题，具有叉头和环指结构域的有丝分裂检查点基因近年来成为抵抗微管靶向性的关键介质。胃癌、结肠癌、子宫内膜癌、肺癌的启动子高甲基化或CHFR蛋白表达减少导致的表观遗传沉默，成为紫杉烷和多西他赛敏感性的预测生物标志物。在胃癌细胞系中， Satoh等[14]首次发现，CHFR表达与微管抑制剂敏感性降低有关。另有研究报道，在胃癌患者中，CHFR甲基化可作为多西他赛敏感标志物[24]。在结肠癌中也有研究表明，CHFR启动子甲基化对多西他赛及吉西他滨敏感性增加[25]。CHFR启动子CpG岛甲基化在预测微管抑制剂反应中具有潜在作用。例如，宫颈腺癌细胞系中有CHFR启动子CpG岛甲基化，对多西他赛和紫杉醇治疗敏感，5-Aza-2-去氧胞苷治疗后CHFR表达立即恢复，对这些药物的敏感性降低[26]。有研究分析了转移性非小细胞肺癌中CHFR失活和紫杉醇的反应，用MSP检测CHFR启动子CpG岛甲基化，通过甲基化微阵列验证，免疫组织化学分析CHFR的核表达。虽然只有1/32的患者观察到CHFR启动子CpG岛甲基化，但16/41的患者显示出CHFR核染色减少，这表明除了启动子CpG岛甲基化外，还有一个CHFR抑制事件有待阐明。在这项研究中，与CHFR核表达升高的患者相比，核CHFR表达减少的患者治疗反应更好并能延长整体生存率[27]。这些研究共同有力地支持了CHFR失活作为紫杉烷、多西他赛敏感性标记的证据。

4 结论与展望

近年来，大量试验研究了CHFR表达失活与肿瘤发生的关系，通常是由于启动子CpG岛甲基化，可以作为预测各种癌症微管抑制剂的预后和反应的生物标志物。大多数的研究都表明CHFR启动子区甲基化与肿瘤的发生具有相关性，并且显示CHFR高甲基化肿瘤细胞对紫杉醇的药物敏感性有影响，但是一部分研究却发现了不同的结论。 Homma等[28]研究发现，在低度恶性非侵袭性胃癌中CHFR高甲基化阳性率为10%，高度恶性非侵袭性胃癌阳性率为63%，在黏膜下侵袭性腺癌的CHFR高甲基化阳性率为35%，高度恶性非侵袭性癌的CHFR甲基化阳性率比低度恶性者高，未发现CHFR高甲基化和染色体不稳定性之间存在相关性。在小凹上皮型和普通表型的肿瘤中频繁发现CHFR高甲基化，在完全肠道化生型中没有发现。另外还发现高甲基化在70岁以上的患者中更为常见,并且在一些非肿瘤的老年人胃上皮中也有发现。因此，尽管CHFR甲基化与染色体不稳定性无关，但一些有凹腔或普通表型的胃肿瘤可能是CHFR年龄相关性甲基化结果。并且Yoshida等[29]回顾性分析41例胃癌患者，通过DNA亚硫酸盐联合限制性内切分析，检测CHFR基因的甲基化状态，并比较甲基化状态对化疗的敏感性，研究表明单独CHFR基因甲基化不能预测晚期和复发性胃癌对多西他赛和紫杉醇的反应，紫杉醇和多西他赛都可能有效治疗胃癌，即使CHFR表达。

CHFR基因甲基化有望作为无创的诊断肿瘤分子标记物，为了更好地应用于肿瘤中，还需进行大样本的数据分析。以往的研究已发现CHFR高甲基化使肿瘤细胞沉默，下一步的实验可以尝试对于化疗药物耐药的细胞给予促进甲基化药物，或者进行甲基化转染，提高肿瘤细胞对药物的敏感性，达到抑制或治疗的目的，因此，可以通过促进或抑制患者CHFR基因甲基化而成为治疗肿瘤的新途径。CHFR甲基化除了对化疗药物敏感外，在放疗方面似乎也有影响，目前已在食管癌中发现它具有放射抵抗性[30]，但由于研究样本数较少，缺乏说服力，还需进一步地研究来证实。