7例犬子宫蓄脓病例的病原菌分离鉴定

陈诗涵，魏润宇，李军朝，管飘萍，黄紫贝，王彦红，张信军，王海燕，刘文博

（1.扬州大学兽医学院，江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009；2.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300）

犬作为伴侣动物，深受人们的喜爱，但随着年龄的增长，易发生多种疾病。中老龄母犬特别是老龄未育犬易发生子宫蓄脓，一般多发生于未生育且年龄超过6岁的中老龄母犬[1]。Tsumagari 等[2]认为，子宫蓄脓一般发生于犬发情后期，因为这一阶段雌激素分泌减少，孕酮作用逐渐增强，导致子宫内膜囊发生泡性增生，腺体分泌大量液体，使生殖道抵抗力降低，继而引发细菌感染[3]。因此，犬子宫蓄脓通常是由于内分泌紊乱和细菌感染共同引起的。此外，周围组织炎症的继发感染、产后感染、交配感染和机械刺激等也能引发该病。

犬患病时主要临床表现为体温升高、精神沉郁、食欲减退、饮欲增加、多尿、呕吐、腹围增大等[4]。根据子宫颈开放与否，子宫蓄脓又分为开放型和闭合型，前者会从阴道中排出脓性或血性分泌物。在子宫蓄脓发生过程中，细菌起到了推波助澜的作用。因此，明确子宫蓄脓病原菌情况，有助于子宫蓄脓的治疗。

本研究对来自江苏省扬州市动物医院的7例犬子宫蓄脓病例进行了整理分析。这7例病例在7～10岁之间，多数曾有过发情史，表现精神不振、食欲不佳、腹胀等症状，体温大多超过38 ℃。经临床检查，包括B 超检查、血常规检查、血液生化检查等，确诊为子宫蓄脓，大多为开放型。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

主要仪器包括：一次性注射器、SW-CJ-1D 型单人净化工作台、接种环、接种棒、指形管、4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、37 ℃恒温培养箱、光学显微镜、不同量程移液器、PCR 热循环仪等；主要试剂包括：血琼脂平板、麦康凯培养基、LB 培养基、革兰氏染液、16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（TaKaRa）、肠杆菌科生化鉴定试剂、生化反应管（杭州微生物试剂有限公司）。测序由南京金斯瑞公司进行。

1.2 细菌分离与培养

用一次性无菌注射器收集病例子宫内容物，作好标记。取病料无菌操作接种于血琼脂平板，置于37 ℃恒温培养箱中1～2 d，观察菌落形状、大小、颜色，观察是否为单一菌株；若为混合株，挑选单个菌落纯化，记录不同菌株菌落形态；再次将单个菌落接种于麦康凯培养基观察菌落形态。

1.3 革兰氏染色镜检

分别对不同菌株进行革兰氏染色，进行革兰氏阳性、阴性菌鉴定。

1.4 生化试验

将上述分离纯化出的菌株，用细菌微量生化反应管进行生化指标检测，置于37 ℃培养箱1 d，观察结果。

1.5 16S rDNA 细菌鉴定

取无菌1.5 mL 指形管，加入1 mL 含4%血清的LB 培养基；挑选单个菌落加入培养基，37 ℃摇菌14～16 h，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min离心2 min，取上清作为DNA模板，进行PCR扩增；使用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 试剂盒（TaKaRa 公司）对PCR 产物进行电泳鉴定，将目的条带切胶送南京金斯瑞公司测序。PCR 体系共25 μL：DNA 模板2 μL、DDW（双蒸水）10 μL、PCR Premix（PCR 预混剂）12.5 μL、上游引物0.25 μL、下游引物0.25 μL；反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸5 min。

2 结果

2.1 菌落特征

1号、3号在麦康凯平板上呈粉红色的圆形菌落，疑似大肠杆菌（图1）；2号、4号在血平板上呈光滑的圆形菌落，疑似肠杆菌科（图2）；5号、6号在血平板为半透明的圆形菌落，疑似铜绿假单胞菌（图3）；7号在血平板上呈灰色、光滑的圆形菌落，疑似大肠杆菌（图4）。

图1 麦康凯培养基1号菌

图2 血平板2号菌

图3 血平板6号菌

图4 血平板7号菌

2.2 染色镜检

染色镜检结果显示，2号是革兰氏阳性球菌，疑似粪肠球菌（图5），其他均是革兰氏阴性杆菌，疑似大肠杆菌（图6）。

图5 革兰氏阳性球菌

图6 革兰氏阴性杆菌

2.3 生化鉴定

生化鉴定结果显示：1号、3号、7号分离细菌生化特性完全符合大肠杆菌特征，4-1、4-2号不完全符合大肠杆菌生化特性，但符合肠杆菌科特性；2号分离细菌生化特性与粪肠球菌相符，5号分离细菌生化特性基本符合产酸克雷伯菌的生化特性，6-1、6-2、6-3号菌生化特性基本符合铜绿假单胞菌的特征。具体结果见表1。

2.4 16S rDNA 细菌鉴定

鉴定结果显示：本试验分离得到的细菌主要是革兰氏阴性杆菌，其中肠杆菌科占大多数，另有1株克雷伯菌和4株球菌（1株粪肠球菌和3株铜绿假单胞菌）。具体结果见表2。

3 讨论

3.1 病原菌

致病菌受环境影响较大，因此不同地区子宫蓄脓致病菌的种类可能不尽相同，有时也分离不出细菌。分离不出细菌的原因可能是子宫本身具有防御机能，也可能是进行了抗菌治疗，而致病菌又对抗菌药极其敏感[5]。本试验从7例病例中分离到10株菌株，其中大肠杆菌3株、铜绿假单胞菌3株、产气肠杆菌2株，以及粪肠球菌和产酸克雷伯菌各1株，说明江苏省扬州市子宫蓄脓的致病菌种类较多。因此，在治疗本病时，要进行细菌分离鉴定，根据致病菌种类和药敏试验，选择敏感药物进行治疗。

表1 细菌生化特性鉴定结果

表2 16S rDNA 细菌鉴定结果

3.2 预防与治疗

母犬早做绝育手术，能有效预防子宫蓄脓的发生。配种时，注意外生殖器卫生，避免细菌感染；子宫周围组织有炎症时，要及时治疗，防止继发感染[6]。平时也要关注犬的健康，定期对其进行体检，包括血常规、生化和影像学检查，尽早发现炎症反应和细菌感染。

患犬在术后仍需进行全身的抗生素治疗，以消除体内炎性反应和潜在的术后感染。部分患犬在术前就诊断出伴发腹膜炎等全身性炎症反应，因此需要在术后恢复期，定期监测血液指标，并根据数据变化及时调整治疗方案。

犬子宫蓄脓病例常发生炎症反应和细菌感染，导致白细胞和中性粒细胞明显增多[7]。因此在药物治疗时，如果血常规检验发现患犬出现核左移数据变化时，提示预后良好；当单核细胞数目明显增多时，表明疾病处于急性感染后期[8]。这对后期的诊疗有一定帮助。

犬子宫蓄脓病例在药物治疗期间，其肝肾并发症出现的频率较高，因此在治疗细菌感染过程中，要进行血液生化检验，注意肝肾指标变化，依此判断肝肾损伤程度，以便制定合理治疗措施以恢复肝肾功能，并保证预后。

目前在国外正在流行使用一些激素类药物治疗子宫蓄脓，其中使用较多的是多巴胺激动剂和孕酮受体阻滞剂。其原理是阻止孕激素的产生或使孕激素无法在体内产生作用[9]。在我国，并未有宠物专用的此类药。对于此类药物的研发，仍需要开展大量试验性研究和临床应用观察。

3.3 试验的局限性与意义

本试验由于病例较少，不能详细分析导致子宫蓄脓病原菌的所有种类，以及病原菌种类分布的概率或者是其他地缘性因素的影响，但病原菌分离鉴定结果，可为临床上子宫蓄脓的治疗提供一定依据。后续需开展病原菌的药敏试验，为该地区犬子宫蓄脓治疗药物的选择提供参考。