禽肾炎病毒与鸡细小病毒双重PCR 检测方法的建立

张艳芳，谢芝勋，邓显文，谢志勤，张民秀，罗思思，谢丽基，范 晴，曾婷婷，黄娇玲，刘加波

（广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001）

禽肾炎病毒（avian nephritis virus，ANV）是引起鸡肠道疾病的重要病原体之一，感染各龄期的鸡，但以侵害雏鸡为主，也可感染火鸡、鸭子和鸽子[1]。该病毒主要引起一种典型的亚临诊症状，虽致病力不强，但感染性强，能在鸡群中迅速传播，广泛见于世界各地，严重的可导致肠炎、肾损伤及肾功能衰竭等，并与鸡矮小综合征有关[2-3]。鸡细小病毒（chicken parvovirus，ChPV）同属鸡肠道病毒，主要侵害雏鸡，可引起以腹泻、精神抑郁、体温调节障碍、生长迟缓、营养吸收障碍等为特征的急性或慢性肠道性疾病，与矮小综合症和营养不良综合症有关，在鸡群中普遍存在，给养鸡业造成较大的经济损失[4-6]。ANV 与ChPV 均可引起雏鸡营养吸收障碍，导致营养不良及矮小综合症的发生，严重危害养鸡业的发展，特别是混合感染时，危害程度尤为明显。多重PCR 可同时检测和鉴别多种病原体，不仅灵敏度高、检测快速、特异性好，且操作简易、能实现标准化[7]，在临床多种病原混合感染的鉴别诊断上具有独特的优势[8-9]。本研究设计了2对ANV 和ChPV 扩增片段大小分别为511 bp和242 bp 的特异性引物，建立了能够同时检测这两种病毒的双重PCR 检测方法。

1 材料

1.1 主要病原体

禽肾炎病毒（ANV）、鸡细小病毒（ChPV）、禽流感病毒H9亚型（AIV-H9）、鸡传染性喉气管炎病毒（AILTV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）、禽呼肠孤病毒（ARV）、马立克病毒（MDV）和大肠杆菌（E.coli），由本实验室保存（表1）。

1.2 主要试剂

DNA/RNA 提取试剂盒、细菌DNA 抽提试剂盒、胶回收试剂盒、2×TaqPCR Mix 均购自北京全式金生物技术有限公司，反转录试剂、pMD 18T Vector、100 bp Marker Ladder 购自大连宝生物公司。

表1 毒株来源

1.3 主要仪器

移液枪，购自法国吉尔森公司；生物安全柜，购自美国Baker 公司；PCR 扩增仪、凝胶成像系统，购自美国Bio-Rad 公司；NanDrop ND-2000微量核酸检测仪，购自美国赛默飞公司；高速离心机，购自美国贝克曼公司；电泳仪，购自北京六一仪器公司等。

2 方法

2.1 引物的设计与合成

根据GenBank 中ANV 的ORF基因和ChPV的NS1基因的保守序列，采用Primer 5.0软件设计引物和DNAStar 软件进行比对筛选，通过NCBI的Blast 验证，设计筛选出了两对ANV 和ChPV特异性引物（表2）。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

表2 两对特异性引物序列

2.2 DNA/RNA 抽提及反转录

参照DNA/RNA 提取试剂盒说明书，提取ChPV、MDV 和AILTV 的DNA；抽 提ANV、AIV-H9、IBV、NDV 和ARV 的RNA，使用反转录试剂按说明书将RNA 反转录成cDNA；使用细菌DNA 抽提试剂盒提取E.coliDNA。均保存于-30 ℃备用。

2.3 反应条件的优化

扩增体系为25 μL：2×PCR Mix 12.5 μL，ANV 的cDNA 和ChPV 的DNA 各1 μL 作为混合模板，2对引物不同比例共加入2 μL（浓度均为20 mol/L），最后用ddH2O 补足25 μL 反应体系。对双重PCR 各引物比例进行优化，选择最佳比例，再设置梯度PCR 选择最适退火温度。反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，退火温度50～60 ℃，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃延 伸10 min，12℃保存。PCR 产物经浓度为1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果，拍照保存。

2.4 特异性试验

利用已优化的双重PCR 方法，对AIV-H9、NDV、ARV、MDV、AILTV、IBV 和E.coli待 检核酸样品进行检测，同时设阴性对照，检验所建立方法的特异性。

2.5 敏感性试验

使用NanDrop ND-2000微量核酸检测仪，测定ANV 和ChPV 的核酸模板浓度，对已知浓度的模板按10倍梯度稀释后，逐一进行双重PCR 扩增，以评估本研究建立的双重PCR 方法的灵敏性。

2.6 临床样品检测试验

对2017年11月至2018年5月广西南宁地区规模化养鸡场采集的40份鸡泄殖腔拭子样品，采集后放入含有双抗的生理盐水中，置于用冰袋维持低温的泡沫箱中密封；当日带回实验室，进行核酸抽提和反转录；应用所建立的双重PCR 方法进行检测，试验重复两次；将目的条带回收、克隆，挑选阳性菌送至赛默飞广州分公司进行测序。

3 结果

3.1 反应条件优化

通过对ANV 和ChPV 引物比例、退火温度和反应时间等条件进行优化，确定了最佳引物组合比例：ANV 上下引物各0.4 μL，ChPV 上下引物各0.6 μL（图1）；最佳退火温度为53.8℃；最佳ANV 和ChPV 的双重PCR 反应体系：2×PCR Mix 12.5 μL，ANV 和ChPV 上下引物共2μL，混合模板2μL，加ddH2O 补足25 μL；PCR 反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，53.8 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃10 min 延伸，12℃保存（图2）。ANV 和ChPV 均可以特异地扩增出相应的目的条带，ANV 为511 bp，ChPV 为242 bp，没有出现非特异性条带。

图1 双重PCR 引物优化试验结果

图2 双重PCR 温度优化试验结果

3.2 特异性试验

利用本研究建立的ANV 和ChPV 双重PCR方法对10份待检样品进行检测。结果显示：ANV扩增出511 bp 的特异性条带，ChPV 扩增出242 bp的特异性条带，AIV-H9、NDV、ARV、MDV、AILTV、IBV和E.coli均没有出现特异性条带（图3）。

图3 双重PCR 特异性试验结果

3.3 敏感性试验

用NanDrop ND-2000微量核酸检测仪测得ANV 和ChPV 的核酸浓度分别为55 ng/μL 和58 ng/μL。将已知浓度的核酸进行10倍梯度稀释，应用优化的双重PCR 对各稀释梯度的模板进行检测。结果显示，本研究建立的双重PCR 最低能同时检测到55 fg 的ANV 和58 fg 的ChPV（图4）。

图4 双重PCR 敏感性试验结果

3.4 临床样品检测

用建立的双重PCR 对实验室采集的40份鸡棉拭子样品进行检测试验，结果检出2份ANV 和ChPV 的混合感染、1份ChPV 阳性、5份ANV 阳性，重复检测结果一致，并且与单重PCR 检测及测序方法得出的结果一致，部分临床样品检测结果见图5。扩增的目的片段与相应序列同源性高达96%～99%。

图5 双重PCR 临床样品检测结果

4 讨论

鸡的肠道类疾病严重危害世界各地养鸡业的发展，给家禽业造成了严重的经济损失。ANV 和ChPV 均属于肠道性疾病病原，鸡的肠炎、生长障碍以及营养不良症状都与这两种病毒有关[2]。虽然这两种鸡病毒的致病性不强，也没有相关大暴发的记录，但根据现有的文献[11]报道，在孵化雏鸡过程中发现ANV 和ChPV 能够垂直传播，并引起孵化率的下降。因此对这两种疾病的监测不容忽视。ANV 和ChPV 引起的临床症状较为相似，主要侵害雏鸡，在临床上容易导致混合感染，给临床诊断带来困难。目前对两种病毒尚没有进行有效的防控，严重地制约了现代养禽业的发展。

传统病毒鉴定方法耗时长，常规的检测方法费时费力，敏感性也不高，无法实现快速诊断。PCR 方法作为实验室常见的实用型分子生物学检测方法，具有操作简易、特异性强、敏感性高、稳定性好等优点。在单重PCR 方法日渐成熟的基础上，双重或多重PCR 方法的报道也较常见，即在一个体系中加入多种引物和模板[12]，一次PCR就能检测多种病原体，当天就能出结果。建立双重PCR 检测方法关键在于引物的设计和筛选。首先，两种病毒检测的目的片段大小要有合适的梯度，确保产物量相对平衡，目的片段大小相差不宜超过300 bp，各引物退火温度尽可能相近。其次，应防止引物和模板之间的非特异性结合，尽量避免产生引物二聚体和防止出现非特性条带[13-14]。本研究根据ANV 和ChPV 的保守基因序列设计和筛选出两对特异性引物，通过优化反应条件和体系，确定最佳引物比例分别是ANV 0.4 μL（20 mol/L）和ChPV 0.6 μL（20 mol/L）。设置50.0～60.0 ℃的退火温度梯度，均能特异地扩增出目的片段，53.8 ℃为本研究建立的双重PCR 方法最佳退火温度。

通过对ANV 和ChPV 双重PCR 的特异性和敏感性试验，可知该方法能同步检测两种病毒，而对常见的鸡病病原包括AIV-H9、MDV、AILTV、IBV、NDV、ARV 和E.coli等进行检测，均没有出现特异性目的条带；灵敏度与单重PCR 一致，最低能检出55 fg ANV 和58 fg ChPV，具有很高的敏感性。此方法降低了成本，节约了时间，能够达到快速检测这两种鸡肠道性疾病的目的。

利用本研究建立的ANV 和ChPV 双重PCR检测方法，对2017年11月至2018年5月采集的40份鸡泄殖腔拭子进行检测，发现与单重PCR 结果一致。因此，本研究建立的双重PCR 检测方法可用于快速检测ANV 和ChPV 的混合感染，既可节约时间、降低成本，又能减少污染，为两种病毒的防控提供了技术支撑。