茵陈内生细菌的分离鉴定与抑菌活性成分分析

鲍永毅，陈 晓，牛明福，李梦圆，付应建，刘瑞文，郑少亭

1河南科技大学食品与生物工程学院 微生物资源开发与利用重点实验室，洛阳 471023；2国家兽用药品工程技术研究中心，洛阳 471003

内生菌(endophyte)是指生活在健康的植物组织或细胞内且不会引起宿主植物明显感染症状的一类微生物群[1]。植物内生菌与宿主植物长期共存[2]，不会改变植物的表型特征和功能，可形成稳定的微生态系统[3]。内生菌具有数量众多、种群结构多样的特点，是潜力巨大的微生物新资源[4]，还可产生与宿主植物相同或相似的活性成分[5]。内生菌的研究对于保护野生与濒危药用植物、拓展药用资源、新药研发等均有重要意义。茵陈(Artemisiacapillaris)，也被称为因尘、绵茵陈、白蒿等，其地上部分是传统中药[6]，具清热利湿、利胆退黄之功效，为治黄疸要药，且可预防流感，治中暑、感冒、水肿等症。植物茵陈中含有多种化学成分，包括香豆素类、黄酮类、色原酮类、有机酸类、烯炔类、三萜类、甾体类和醛酮类等[7]。茵陈多为野生，其采收较麻烦且受季节限制，研究茵陈内生菌并研究其活性产物与茵陈成分的相关性，对于拓展茵陈药用范围和新药发现具有重要意义[8]。对一些内生细菌发酵产物研究，发现发酵液中的一种或几种成分具有抗菌作用(含细菌与真菌)，有研究表明， 80%的植物内生真菌在抗真菌、抗藻类或抗杂草方面具有活性，而来自土壤的真菌中只有大约43%具有活性[9]。近些年来，已从各种中草药中分离到了大量的内生菌，但茵陈内生菌的研究较少，且内生细菌的分离鉴定还未见有报道。本研究为了解茵陈内生细菌的组成和种类，并从中筛选产茵陈相同或相似抑菌活性物质的内生菌，为利用微生物发酵生产药物提供资源。

1 材料与方法

1.1 材料与方法

1.1.1 实验材料

新鲜完整植株茵陈采摘于河南省洛阳市南郊外龙门山，经河南科技大学林学院许晓利老师鉴定。

1.1.2 培养基

因不同内生细菌对营养的要求各异，本试验选用以下7种培养基进行内生细菌的分离，LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂20，pH7.0。KMB培养基(g/L)：蛋白胨20，无水氯化镁1.4，无水硫酸钾10，琼脂15，甘油10，pH7.2。PDA培养基(g/L)：土豆 200，葡萄糖 20，琼脂20，自然pH值。营养琼脂(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，琼脂20，pH7.2。YPD培养基(g/L):酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20，琼脂20，pH7.2。TSA培养基(g/L)：酪蛋白胰酶消化物15，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5，NaCl 5，琼脂20， pH7.2。BPA培养基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨5，葡萄糖 10，酵母粉1，琼脂20，pH7.2。纯化及菌种的保藏仍使用相应的分离培养基。

1.1.3 测试菌

肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和产肠毒大肠埃希氏菌(enterotoxigenicEscherichiacoli)为本实验室保存。

1.2 内生细菌的分离与纯化

将采集到的茵陈根茎叶流水冲洗后，先于75%乙醇溶液中浸泡3 min，无菌水冲洗3次，然后在0.1% HgCl2溶液中漂洗3 min，无菌水冲洗4次。茵陈样品置于无菌研钵中，加入适量无菌水研磨至浆状，梯度稀释，分别涂布于上述7种固体培养基上，最后一次冲洗后的无菌水也涂布平板作为对照，37 ℃培养3～4天，无菌水对照应无菌长出，挑选梯度稀释的平板上的不同单菌落平板划线纯化。

1.3 菌落观察与镜检

观察各种培养基分离到的菌落形态，并进行革兰氏染色镜检。

1.4 分子生物学鉴定

采用细菌基因组DNA小量提取试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)提取纯化菌株的基因组DNA。以16S rDNA通用引物27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和1492R：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′进行PCR扩增，扩增体系(50 μL)为：2×Taq PCR Mix 25 μL，去离子水19 μL，引物27F 2 μL，引物1492R 2 μL，基因组DNA模版2 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，35个循环，72 ℃终延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送上海生工生物工程有限公司测序，序列结果提交GenBank，使用DNAStar中的Megalign进行同源性分析，通过BLAST程序在GenBank上进行相似性序列检索分析，并利用DNAStar7.1软件的MegAlign程序构建系统发育树。

1.5 内生细菌发酵液的抑菌活性测定

将52株内生细菌分别接种于不同培养基中，37 ℃摇床震荡培养72 h，离心收集上清液，96孔板法测定对S.enteritidis、S.aureus和enterotoxigenicE.coli的抑菌活性，具体方法如下：在96孔板中分别加入发酵上清液100 μL，用PBS倍比稀释三个梯度，每个梯度三个重复，然后每孔中加入活化的测试菌(106个/mL)各100 μL，同时用恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)做阳性对照，培养基做阴性对照，37 ℃培养12 h，酶标仪测定OD600。抑制率计算公式为(OD阴性对照-OD阳性对照或样品)/OD阴性对照×100%，结果判定标准为：抑制率为75～100%判定为“++++”， 抑制率为50%～75%判定为“+++”， 抑制率为25%～50%判定为“++”， 抑制率为0～25%判定为“+”。

1.6 内生细菌发酵液的成分初步分析

参照中药茵陈的化学成分，分别以没食子酸、芦丁、咖啡酸和齐墩果酸作为标准品，利用分光光度法测定抑菌活性较强的菌株发酵液成分，具体测定方法参照文献[10-13]。

1.7 内生细菌发酵液的成分初步测定

1.7.1 发酵液上清处理

发酵液上清处理方法参照文献[14]进行，具体方法如下：用无菌吸管吸取10 mL的发酵液12 000 rpm离心10 min，收集上清液。取上清液1 mL与9 mL色谱纯甲醇混匀沉淀24 h，再12 000 rpm离心10 min，上清液0.22 μm滤膜过滤作为高效液相色谱的测试液。

1.7.2 HPLC 色谱条件及检测方法

准确称取没食子酸、芦丁、咖啡酸和齐墩果酸各种标品5 mg 置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，用抽滤器和微孔滤膜过滤，作为标准品母液。然后各取0.1 mL 标准品母液混合均匀后加入2.2 mL 甲醇配成20 g/L 的混合标准品溶液。

色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax ODS-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；流速为1.0 mL /min;柱温为室温(30 ℃) ；进样量10 μL。流动相和检测波长分别为：没食子酸流动相甲醇∶0.1%磷酸=10∶90；检测波长为280 nm。芦丁流动相甲醇∶0.1%磷酸=85∶15；检测波长为390 nm。咖啡酸流动相甲醇∶0.1%磷酸=20∶80；检测波长为323 nm。齐墩果酸流动相甲醇∶0.1%磷酸=85∶15；检测波长为210 nm。

图1 9种茵陈内生细菌的镜检形态图(1 000×)Fig.1 Microscopic morphology of nine endophytic bacterial strains of Artemisia capillaris(1 000×) 注： A 枯草芽孢杆菌(NA-1)；B 简单芽孢杆菌(NA-5)；C 短小芽孢杆菌(NA-6)；D蜡样芽孢杆菌(LB-8)；E 巨大芽孢杆菌(TSA-18)；F 病研所芽孢杆菌(LB-11)；G 地衣芽孢杆菌(BPA-29)；H 屎肠球菌(LB-13)；I 醋酸钙不动杆菌(KMB-32)。Note:A B.subtilis (NA-1);B B.simplex (NA-5);C B.pumilus (NA-6);D B.cereus (LB-8);E B.megaterium (TSA-18);F B.idriensis (LB-11);G B.licheniformis (BPA-29);H Enterococ- cus faecium (LB-13);I Acinetobacter calcoaceticus (KMB-32).

2 结果与分析

2.1 内生菌的分离纯化

对初步分离到的细菌进行划线分离纯化，经菌落形态和镜检观察后，共获得85株内生菌，其中从NA培养基中筛选到10株菌；从LB培养基中筛选到25株菌；从TSA培养基中筛选到5株菌；从BPA培养基中筛选到19株菌，从KMB培养基中筛选到16株菌；从YPM培养基中筛选到6株菌；从PDA培养基中筛选到4株菌。

对上述85株菌又进行多次分离纯化并进行镜检分类，最终确定得到52株内生细菌。其中NA培养基6株，LB培养基17株，TSA培养基6株，BPA培养基8株，KMB培养基8株，YPM培养基5株， PDA培养基2株，对这52株内生细菌进行编号处理并进行下一步的鉴定。

2.2 菌体形态观察

52株内生细菌革兰氏染色观察有51株为阳性菌，多为杆状，只有LB13为球形；另1株KMB32革兰氏染色为阴性，为长细杆状，具体形态见图1。

2.3 同源性分析

内生细菌的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，均在约1 500 bp处出现条带，部分PCR条带见图2。

图2 内生细菌PCR产物电泳图Fig.2 PCR amplification from the endophytic bacteria 注：M：DL2 000 DNA 分子量 ；1～10：茵陈内生细菌菌株(部分)16S rDNA PCR扩增产物。Note:M:DL2 000 DNA Marker;1～10:PCR amplification of 16S rDNA from the endophytic bacteria (partly).

将52株菌的16S rDNA序列上传NCBI GenBank数据库，登录号见表2。根据16S rDNA 分类标准，对52株内生细菌进行同源性分析，可分为6组，同源率在99%以上的有4组，同源率在95%～99%之间的有1组，同源性在95%以下的有1组，结果见表1。

表1 分离菌株序列分析统计结果Table 1 Results of sequence analysis of isolated strains

2.4 系统进化分析

根据同源性分析结果，在同源率99%以上的4组分离菌中各选几株代表(7株：NA-1、NA-2、KMB-31、KMB-34、LB-7、BPA-22和TSA-20)，同源率99%以下的分离菌(8株：LB-3、KMB-32、BPA-29、NA-5、LB-11、LB-12、LB-13、LB-16)与GenBank公布的序列比对，构建系统发育树见图3。NA-1、NA-2、KMB-31和KMB-34与枯草芽孢杆菌亲缘关系较近；LB-16、 BPA-29、LB-12和LB-3与地衣芽孢杆菌亲缘关系较近；TSA-20与短小芽孢杆菌亲缘关系较近；LB-11与病研所芽孢杆菌亲缘关系较近；LB-2、LB-1和BPA-22与蜡状芽孢杆菌亲缘关系较近；LB-7与巨大芽孢杆菌亲缘关系较近；NA-5与简单芽孢杆菌亲缘关系较近；LB-13与屎肠球菌亲缘关系较近；KMB-32与醋酸钙不动杆菌亲缘关系较近。

NCBI BLAST比对分析结果表明LB-13为屎肠球菌，KMB-32为醋酸钙不动杆菌，其他50株菌为芽孢杆菌，与2.2的革兰氏染色镜检结果相吻合，结果见表2。

图3 茵陈内生细菌系统发育树构建Fig.3 Phylogenetic tree construction of Artemisia capillaris endophytic bacteria

2.5 内生细菌发酵液抑菌活性测定结果

52株内生细菌发酵液对3种指示菌的抑菌结果见表3，其中17株菌对这3种指示菌均有不同程度的抑菌效果，另35株菌对3种指示菌未检测到抑菌活性。

表2 从茵陈中分离的52株内生细菌菌株编号、GenBank登录号及菌株分类Table 2 The strain numbers,GenBank numbers and classification of the 52 endophytic bacteria strains isolated from Artemisia capillaris

续表2(Continued Tab.2)

菌株编号No.GenBank登录号GenBank acession No. 菌株名称Strain nameBPA-28MH187618枯草芽孢杆菌B.subtilisBPA-29MH187617地衣芽孢杆菌B.licheniformisKMB-30MH187616枯草芽孢杆菌B.subtilisKMB-31MH187615枯草芽孢杆菌B.subtilisKMB-32MH187651醋酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticusKMB-33MH187650枯草芽孢杆菌B.subtilisKMB-34MH187614枯草芽孢杆菌B.subtilisKMB-35MH187613枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisKMB-36MH187612枯草芽孢杆菌B.subtilisKMB-37MH187611枯草芽孢杆菌B.subtilisYPM-40MH187608枯草芽孢杆菌B.subtilisYPM-41MH187607巨大芽孢杆菌B.megateriumYPM-42MH187606枯草芽孢杆菌B.subtilisYPM-43MH187605枯草芽孢杆菌B.subtilisYPM-44MH187604枯草芽孢杆菌B.subtilisPDA-48MH187640巨大芽孢杆菌B.megateriumPDA-49MH187639枯草芽孢杆菌B.subtilis

表3 17株内生细菌对3种指示菌的抑菌效果Table 3 The antibacterial activity of the 17 strains of endophytic bacteria against the 3 indicator bacteria

2.6 内生细菌发酵液的成分初步测定

对抑菌活性为“+++”的菌株NA-3、BPA-24和KMB-32发酵液进行分光光度法测定，结果见表4、表5。

表4 4 个化合物标准品的线性回归方程及线性范围(n=3)Table 4 4 Linear regression equations with linear ranges for 4 compounds (n=3)

表5 三个菌株发酵液中化合物含量Table 5 Compound contents in the fermented liquid of three strains

2.7 HPLC 色谱结果

标准品没食子酸、芦丁、咖啡酸和齐墩果酸的出峰时间分别在8.406、5.794、26.724和23.084 min，相同条件下，3个菌株的发酵液在没食子酸、芦丁和咖啡酸相应的出峰时间均未出现相应的峰，齐墩果酸相同时间点有峰出现，色谱图见图4，从出峰时间可以推测3个菌株发酵液中可能含有齐墩果酸。

3 讨论

药用植物是筛选天然药用成分的主要原料之一，但从药用植物中直接提取获得药用成分的工艺复杂，含量低，且药用植物易受地理环境及时令的限制[15]。通过培养药用植物内生菌来生产药用活性成分不仅可以突破植物生长周期长、产量低、不可再生等限制，同时也可以为内生菌大规模发酵生产药用活性物质开辟新途径[16]。

茵陈素有“二月茵陈，五月蒿”的说法，茵陈一年只有春季和秋季两个采收期，种植周期长，采摘麻烦，分离茵陈内生菌进行茵陈药用成分的发酵生产不失为一种理想方法，而查阅文献仅见左飞[17]进行了茵陈放线菌的分离与抗杨树褐斑病的活性研究，其他未见有相关报道。本研究对茵陈内生细菌进行分离纯化，最终得到52株内生细菌，有50株为不同种类的芽孢杆菌，1株醋酸钙不动杆菌，1株屎肠球菌，可以看出茵陈内生细菌中芽孢杆菌为优势菌，这与从其他药用植物中分离出的内生细菌多为芽孢杆菌是一致的[18-20]。但本实验初步分离纯化的85株内生细菌中革兰氏阴性菌有18株，革兰氏阳性菌有67株，最终分离纯化后仅剩下了1株革兰氏阴性菌，考虑与分离纯化过程中人为操作有关，也有文献报道[21]有些内生菌不适合体外多次传代培养，推测在纯化过程中丢失。

图4 齐墩果酸的HPLC色谱图Fig.4 HPLC Chromatogram of oleanolic acid 注：A :齐墩果酸标准品；B、C和D分别为菌株NA-3，BPA-24和KMB-32发酵液上清。Note:A:standard of Gallate;B，C and D are fermentation liquid supernatants of strains NA-3,BPA-24 and KMB- 32,respectively.

Chen等[22]报道植物内生细菌中未培养微生物占很大比例，培养方法分析的细菌仅限于那些能够在人工培养基上生长的细菌，一些适合于分离培养基营养条件的菌株在分离过程中大量富集，而不适合于分离培养基营养条件的菌株在分离过程中逐渐衰退。许多研究已经证实，通过传统的分离培养方法鉴定的微生物仅占环境微生物总数的0.1%～10%[23]，应用高通量测序技术能更准确反映植物内生微生物的种类组成和真实比例，但微生物发酵生产活性物质需要可持续培养的微生物，所以传统的分离培养方法仍是内生菌分离的主要方法。

本研究对分离培养的内生细菌发酵液进行初步抑菌活性测定，筛选到17株能产生抑菌活性物质的内生细菌，为下一步内生菌产生活性物质的研究奠定了基础。其中对抑菌活性较强的三个菌株发酵，发酵液进行分光光度法和高效液相色谱分析，发现发酵液中含有齐墩果酸，且菌株NA-3和KMB-32发酵液中齐墩果酸含量较高，为直接发酵生产齐墩果酸提供了素材。虽然分光光度法测定发酵液中含有酚类和黄酮类，但液相色谱未测到没食子酸和芦丁，推测可能是发酵液中含有其他的酚类和黄酮类物质，下一步将进一步对发酵液进行分离分析，确定发酵液中的成分及发挥抑菌活性的具体成分。