玉米穗三叶叶宽QTL定位及Meta分析

张莹莹，杨 青，代资举，王 艳，王新涛

(河南省农业科学院 作物设计中心，河南 郑州 450002)

叶片是影响植株构型的重要因素，同时也是植株进行光合作用的主要器官。合理的叶片结构有利于植株叶片的合理分布，从而影响植株的株型结构以及光合效率[1-3]。叶宽是影响叶片形态的主要因素，对植株的光合能力有着重要影响。一方面，较窄的叶片有利于透光，但会影响自身对于光的吸收；另一方面，叶片较宽又会影响下层叶片对于光的吸收，从而降低整体的光合效率[4]。因此，研究玉米叶宽形成的分子机制，对于玉米植株株型改良以及光合效率提高有着重要意义。

玉米叶宽是由多基因控制的数量性状，目前国内外研究者通过QTL定位方法，利用不同的遗传群体材料对叶宽进行遗传分析，在10条染色体上均定位到与叶宽相关的QTL[5-16]。REYMOND等[5]利用F-2与Io构建的145个重组自交系(RIL)群体对玉米叶宽进行QTL定位，检测到9个与叶宽有关的QTL。郑祖平等[6]利用Mo17与黄早四为亲本构建的RIL群体在不同供氮水平下检测到2个与玉米穗位叶叶宽相关的QTL，且位于第5号染色体的QTL为主效QTL，可解释17.32%的表型变异。KU等[7-8]利用分别由Yu82和Shen137以及Yu82和Yu87-1为亲本构建的2套F2:3群体，共检测到9个与叶宽相关的QTL，可解释表型变异率为4.86%～20.40%。LIU等[9]利用以S-951和Q319为亲本构建的RIL群体和IF2群体对玉米叶宽进行QTL定位，在3个不同环境下检测到47个QTL，可解释表型变异率为3.5%～17.0%，其中检测到14个与穗三叶叶宽有关的QTL，可解释表型变异率为5.4%～13.4%。

玉米果穗叶及其上下两叶合称为穗三叶，其叶面积最大，功能期最长，与玉米籽粒形成时期较为一致，对玉米生长发育及产量形成有着重要影响，而叶宽又是影响叶片形态的主要因素[17-18]。因此，研究穗三叶叶宽的遗传机制可以为玉米株型的遗传改良提供理论依据。国内外研究人员发现了许多与玉米穗三叶叶宽有关的QTL[5-16]，但不同研究中QTL数目以及位置存在差异，且目前有关玉米穗三叶叶宽的Meta-QTL分析还鲜有报道。Meta分析可利用统计学原理对不同来源的QTL进行整合分析，缩小QTL置信区间，发掘稳定的QTL位点。基于此，本研究以玉米自交系郑58和D863F为亲本，构建了包含241个家系的RIL群体，利用215对SSR标记构建遗传图谱，在3个不同环境下对玉米穗三叶叶宽进行QTL分析，检测稳定表达的QTL位点，之后整合不同遗传群体定位到的有关玉米穗三叶叶宽的QTL，通过Meta-QTL分析，发掘控制玉米穗三叶叶宽的一致性QTL(mQTL)，为下一步玉米穗三叶叶宽主效QTL的精细定位和优良株型育种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以玉米自交系郑58和D863F为亲本，从F2代后采用单粒传法连续自交至F7代，构建含有241个家系的RIL群体。

1.2 田间试验及表型数据测定

1.3 遗传图谱的构建

运用CTAB法[19]提取郑58和D863F及其群体的基因组DNA，筛选出均匀覆盖玉米10条染色体的SSR标记，并进行多态性筛选，选出亲本间有差异的SSR标记215对，利用这些SSR标记对群体以及亲本DNA进行分析。利用JoinMap 4.0软件进行遗传图谱绘制。

1.4 QTL定位方法

运用QTL IciMapping 4.0软件的完备区间作图法[20]对3个环境下的穗三叶叶宽进行QTL检测。按照软件默认值设置参数，LOD阈值为2.5，QTL显著性阈值为P<0.01水平，通过1 000次排列检测确定。QTL命名方式为q-性状命名-环境-所在染色体，其中，原阳、西平、乐东3个环境分别用1、2、3来表示。若1个染色体上存在多个QTL位点，则在染色体后加数字1、2、3等加以区分。

1.5 玉米穗三叶叶宽的Meta分析

从已发表文献中收集与玉米穗三叶叶宽有关的QTL信息[6,9-14]，主要包括作图群体类型、群体大小、QTL数目、QTL位置、LOD值、置信区间以及贡献率等。以IBM2 2008 Neighbors为参考图谱，对不同来源的穗三叶叶宽QTL进行整合，对置信区间未知的QTL，根据DARVASI等[21]的公式推断其95%置信区间。

C.I.=530/(N×R2)

(1)

C.I.=163/(N×R2)

(2)

其中，C.I.为置信区间，N代表作图群体大小，R2代表贡献率，公式(1)适用于回交和F2作图群体，公式(2)适用于RIL作图群体。之后利用BioMercator 4.2软件将所收集的图谱与参考图谱进行比对，对QTL进行整理。mQTL命名规则为m-QTL-性状-所在染色体。

2 结果与分析

2.1 不同环境下玉米穗三叶叶宽表型数据分析

对原阳、西平、乐东3个环境下的玉米亲本及RIL群体的穗三叶叶宽进行测量并分析，结果(表1)显示，3个环境下，郑58和D863F的穗三叶叶宽均存在极显著差异，D863F的穗三叶叶宽(9.7～11.4 cm)均高于郑58(7.0～7.9 cm)。在RIL群体中，穗三叶叶宽(5.20～11.93 cm)存在明显的超亲分离，且在3个环境下，玉米穗三叶叶宽在群体中表现出连续变异(图1—3)，基本符合正态分布，属于典型的数量性状遗传特点，适宜于QTL定位研究。

表1 不同环境下玉米穗三叶叶宽表型值的描述统计

注：**表示t测验0.01水平上差异极显著。

Note：**mean significantly different at 0.01 probability level by usingt-test.

图1 原阳环境下RILs群体穗三叶的叶宽分布

图2 西平环境下RILs群体穗三叶的叶宽分布

图3 乐东环境下RILs群体穗三叶的叶宽分布

对3个环境下玉米RIL群体的穗下叶、穗位叶、穗上叶的叶宽数据进行方差分析(表2)发现，穗下叶、穗位叶、穗上叶叶宽在家系、环境以及家系×环境互作下的差异水平均达到极显著水平，且均具有较高的广义遗传力，分别为93.69%、93.37%、92.83%。

表2 不同环境下玉米穗三叶叶宽的方差分析

注：**表示在0.01水平上差异极显著。

Note：**mean significantly different at 0.01 probability level.

2.2 玉米RIL群体遗传图谱的构建

对亲本郑58和D863F进行多态性SSR标记筛选，共鉴定出有差异性的标记215对。构建遗传图谱全长为1 832.35 cM，平均图距为8.52 cM，其中第8号染色体标记密度最高，平均遗传距离为8.13 cM(图4)。

图4 玉米RILs群体遗传图谱

2.3 不同环境下玉米穗三叶叶宽QTL定位结果

在3个不同环境条件下，检测到与穗三叶叶宽有关的QTL共17个，分别位于5、6、8号染色体上，除6号染色体上检测到的qFirLW2-6增效基因来源于郑58，其余QTL的增效基因均来自于D863F。原阳、西平、乐东3个环境下分别检测到5、7、5个与穗三叶叶宽有关的QTL，单个QTL可解释表型变异率为5.30%～12.77%，表明穗三叶叶宽是受多基因控制的数量性状(表3)。

表3 玉米RILs群体穗三叶叶宽的QTL分析结果

3个环境下，均于8号染色体bnlg1056—bnlg1131区间内检测到与穗上叶叶宽有关的QTL，可解释表型变异率为9.93%～12.77%；同时，在该位点也检测到与穗下叶叶宽及穗位叶叶宽有关的QTL，可解释表型变异率为10.53%～12.34%，表明该位点是一个控制穗三叶叶宽的主效QTL。在5号染色体umc2216—umc2201和8号染色体umc1882—umc1959区间内，同时在原阳和西平2个环境下检测到与穗下叶叶宽有关的QTL，可解释表型变异率7.40%～8.43%；且在西平环境下，5号染色体umc2216—umc2201区间和8号染色体umc1882—umc1959区间内还检测到与穗位叶叶宽有关的QTL，可解释表型变异率分别为9.27%、8.35%。另外，在乐东环境下，5号染色体umc1253—bnlg1006区间，检测到与穗下叶叶宽、穗位叶叶宽有关的QTL，可解释表型变异率分别为8.84%、11.27%。其余位点则是在单环境下检测到的单QTL位点，解释表型变异率为5.30%～5.89%。

2.4 玉米穗三叶叶宽的QTL映射及Meta分析

收集整合文献报道的控制玉米穗三叶叶宽的119个QTL，将其同本研究定位到的17个QTL共同映射到整合图谱上，共计获得20个mQTL(表4)，置信区间为3.61～33.83 cM。除10号染色体外，在1—9号染色体上均获得了mQTL，其中，在 1、3、4号染色体上均获得了3个QTL，在2、5、6、8、9号染色体上均获得2个mQTL，7号染色体上获得1个QTL。每个mQTL包含2个及以上的不同QTL。结合表3可以看出，本研究检测到的5号染色体上的qThiLW2-5位于mQTL5-1区段内，6号染色体上的qFirLW2-6位于mQTL6-1区段内，8号染色体上的qFirLW1-8、qFirLW2-8、qSecLW2-8位于mQTL8-1区段内。

表4 玉米穗三叶叶宽mQTL及其相关信息

3 结论与讨论

叶宽是复杂的数量性状，遗传背景、群体类型以及试验环境的差异会造成其QTL定位结果的不同。本研究通过由穗三叶叶宽存在显著差异的亲本郑58和D863F及其构建的RIL群体对玉米穗三叶叶宽进行QTL定位，共计定位到17个与叶宽有关的QTL，其中有3个QTL在2个及以上环境均能检测到，分别位于5、8号染色体上。利用IBM2 2008 Neighbors图谱对不同遗传群体、不同环境条件以及不同的标记定位到的玉米穗三叶叶宽相关QTL进行整合分析，获得相同或邻近染色体位置的mQTL。其中，mQTL5-1、mQTL6-1、mQTL8-1三个mQTL均含有本研究所定位到的QTL位点。

与前人研究结果比较发现，在5号染色体umc1680—phi101区间内定位到qThiLW2-5与LIU等[9]通过IF2和RIL群体检测到的结果一致，在本研究的元分析结果中也得到验证；LIU等[9]的研究还表明，该位点与玉米穗上叶叶宽也有关联，证明该位点很可能存在控制玉米叶宽的基因。另外，在5号染色体umc1253—bnlg1006区间内定位到的qFirLW3-5、qSecLW3-5与WANG等[15]的研究结果一致。在8号染色体umc1882—umc1959区间内定位到的与穗下叶、穗位叶有关的qFirLW1-8、qFirLW2-8、qSecLW2-8与GUO等[11]的研究结果一致，在元分析结果中得到验证，位于mQTL8-1区间内。

本研究在2个环境下均定位到5号染色体umc2216—umc2201区间内存在1个与穗下叶叶宽的有关的QTL位点，该位点也与穗位叶叶宽有关，郭书磊等[22]对不同研究检测到的QTL进行Meta-QTL分析，发现该位点存在1个与叶形有关的mQTL，并且经过候选基因分析发现，该位点区域内含有1个GRF1基因。研究表明，玉米GRF家族是一类转录激活因子，能够调控不同组织器官的发育，从而影响植株的形态建成。GRF1过量表达能够导致叶片变大，而GRF10过表达会导致叶片变小、变窄[23]。KIM等[24]、HORIGUCHI等[25]研究表明，GRF家族过表达能够通过调控细胞分裂和膨大来调控叶片的形态大小。推测GRF家族可能参与玉米穗三叶的形态发育。本研究在8号染色体bnlg1056—bnlg1131区间内检测到与穗三叶叶宽均有关的QTL位点，且在3个环境下均检测到，证明该位点是一个可以稳定表达的遗传位点。ZHAO等[26]通过全基因组关联分析在该区段内同样发现了控制叶宽的显著性位点，通过对该区段的候选基因进行分析，发现了1个与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶有关的基因，其与C4植物光合作用中二氧化碳的固定反应有关。本研究为揭示玉米穗三叶叶宽的遗传机制以及玉米的优良株型育种提供了理论依据。