抗猪瘟病毒中和性单克隆抗体的制备与鉴定

刘运超，陈玉梅，冯丽丽，汪 磊，王聚财，陆东峰，张改平

(1.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点开放实验室，河南 郑州 450002；2.郑州大学 生命科学学院，河南 郑州 450001；3.河南省农业科学院 农业经济与信息研究所，河南 郑州 450002；4.河南花花牛实业总公司，河南 郑州 450006)

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种接触性、急性、高度致死性传染病，该病在世界范围内流行，给全球养猪业带来巨大经济损失[1]。CSFV是一种黄病毒科CSFV属的单股正链RNA囊膜病毒，基因组共编码12种蛋白质(Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)[2-3]。其中，C、Erns(gp44/48)、E1(gp33)、E2(gp55)蛋白为病毒的主要结构蛋白，其余8个为非结构蛋白。结构蛋白E2分子质量约55 ku，为糖基化的囊膜蛋白，主要位于病毒粒子表面，在病毒入侵细胞的过程中发挥重要作用[4-8]；同时E2蛋白也是CSFV主要保护性抗原，能够诱导机体产生抗CSFV中和抗体，抵抗病毒的入侵[9-11]。采用杆状病毒系统表达制备的CSFV E2蛋白，可有效刺激机体产生高滴度的抗CSFV特异性抗体和中和抗体，能够有效抑制病毒感染[12-13]。重组腺病毒载体表达的E2蛋白也能够有效保护机体免受CSFV攻击[14-15]；相关疫苗和免疫学研究结果显示，高滴度抗E2蛋白抗体可有效抑制病毒感染与复制[16-18]。

前人以CSFV E2蛋白为免疫原制备了一系列的单克隆抗体，广泛应用于CSFV诊断方法的建立[19-20]。中性单克隆抗体能够有效抑制病毒感染活性，在病毒与宿主的相互作用、病毒中和性抗原表位研究和免疫评价方法建立方面发挥重要作用。但是，具有中和活性的CSFV单克隆抗体报道较少，限制了CSFV的相关研究[21-24]。为此，分别以CSFV SM株和杆状病毒表达的CSFV E2蛋白免疫BABL/c小鼠，用经典的杂交瘤技术筛选针对CSFV E2蛋白中和表位的特异性单克隆抗体，为进一步研究CSFV中和性抗原表位和免疫评价方法建立提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 毒株、E2蛋白及细胞

CSFV SM株、牛流行性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV2)均由本实验室保存；大肠杆菌表达的CSFV E2蛋白及杆状病毒表达CSFV E2蛋白由本实验室构建、表达并纯化；小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒和CSFV单克隆抗体WH303购自Proteintech公司；HRP标记的羊抗鼠IgG购自武汉三鹰生物公司PK15细胞、MBDK细胞、Marc145细胞均由本实验室保存，以含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。PK15细胞用于CSFV和PCV2增殖、MBDK细胞用于BVDV增殖、Mac145细胞用于PRRSV病毒增殖；PRRSV单克隆抗体由本实验室保存；骨髓瘤细胞NS0由本实验室保存，以含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基培养。

1.2 供试动物

6～8 周龄SPF级BALB/c纯系雌性小鼠购自郑州大学医学院实验动物中心。

1.3 抗原制备

CSFV SM株接种PK-15细胞，扩繁后收集病毒，经Millipore Pellicon切向流超滤系统超滤浓缩后，采用Sepharose 4 Fast Flow层析柱纯化获得CSFV病毒。向纯化病毒液中加入1∶2 000稀释的β-丙内酯，4 ℃放置72 h灭活病毒。杆状病毒表达的CSFV E2蛋白以及原核表达的CSFV E2蛋白均带有组氨酸标签，经Ni柱亲和层析纯化后备用。

1.4 动物免疫

6～8周龄的BALB/c小鼠共6只，分为A、B 2组，每组3只，其中A组小鼠免疫CSFV，B组小鼠免疫经过纯化的杆状病毒表达E2蛋白。首次免疫每只200 μL免疫原(CSFV TCID50=106.5或25 μg E2蛋白)颈背部皮下多点注射，每隔21 d免疫1次，共免疫3次。首次免疫采用弗氏完全佐剂，第2、3次免疫用弗氏不完全佐剂，免疫方式与剂量同前。第3次免疫后14 d，采用间接ELISA测定免疫小鼠效价，同时采用IDEXX CSFV抗体检测试剂盒检测免疫小鼠血清阻断率，具体操作参照试剂盒说明书。分别选取A、B 2组阻断价高的小鼠进行加强免疫，加强免疫分别选用不含佐剂的CSFV和杆状病毒表达E2蛋白抗原，按50 μg/只的剂量进行腹腔注射。

1.5 细胞融合

加强免疫后3～5 d，脱颈处死小鼠，无菌取脾脏，制备脾细胞悬液，与生长状态良好的NS0骨瘤细胞混合，按照文献[19]所述方法进行细胞融合。以HAT培养基对融合后细胞进行选择培养，将悬浮细胞均匀铺至20块96孔板，每孔300 μL，培养10 d后用免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)进行阳性克隆筛选，选择强阳性孔进行3～5轮亚克隆筛选，获得能稳定分泌抗CSFV E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

1.6 免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)

IPMA用于检测单克隆抗体的特异性和敏感性。将PK15细胞铺至96孔细胞培养板，长成单层时用CSFV感染细胞，同时设未感染细胞为空白对照，感染后24 h用含3% H2O2的甲醇固定液室温固定15 min，弃去固定液，用含 5% 脱脂奶粉的PBST溶液37 ℃封闭1 h，每孔加入待检细胞上清50 μL，同时以商品化CSFV单克隆抗体WH303为阳性对照，37 ℃孵育30 min，PBST洗6次，每孔加入50 μL(1∶1 000稀释)的HRP标记的羊抗小鼠二抗，37 ℃孵育30 min，每孔加入50 μL的AEC显色液5～10 min，显微镜下观察，待阳性对照孔充分显色后，用双蒸水终止显色，记录试验结果。用IPMA检测抗体敏感性时，每孔加入50 μL梯度稀释的单克隆抗体细胞上清或单克隆抗体腹水。

1.7 单克隆抗体腹水的制备及效价测定

将阳性杂交瘤细胞进行扩大培养，收集备用。取BALB/c小鼠，腹腔注射液体石蜡(0.5 mL/只)，10 d后腹腔注射5×105～5×106个杂交瘤细胞。8～12 d后采集小鼠腹水，37 ℃静置1 h，4 500 r/min离心10 min，吸取上清-20 ℃保存备用。采用间接ELISA和IPMA检测4株单克隆抗体腹水的效价，从1∶1 000开始进行2倍倍比稀释，每孔加入50 μL倍比稀释的单克隆抗体腹水进行IPMA检测。

1.8 CSFV E2 蛋白单克隆抗体的鉴定

分别选用IPMA、ELISA、Western blot鉴定单克隆抗体特异性。分别用CSFV感染PK15细胞、BVDV感染MBDK细胞、PRRSV感染Marc145细胞、PCV2感染PK15细胞进行IPMA试验，同时设未感染细胞作对照，具体方法参照1.6。Western blot鉴定：分别将经杆状病毒表达纯化获得的CSFV E2蛋白以及原核表达的CSFV E2蛋白进行SDS-PAGE电泳，一块胶用考马斯亮蓝染色液观察。另一块胶用半干法转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的PBST封闭1 h，PBST洗3遍，分别用杂交瘤细胞上清作为一抗，室温轻轻振荡孵育1 h，PBST洗涤6次。以1∶1 000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗室温孵育30 min，PBST洗涤6次，AEC显色，双蒸水终止反应，观察并记录试验结果。采用Proteintech公司生产的单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，按照产品说明书操作，对单克隆抗体进行亚型鉴定。

1.9 中和性单克隆抗体的筛选与鉴定

采用IPMA检测单克隆抗体的中和活性，设PRRSV单克隆抗体腹水为阴性对照(NC)。将单克隆抗体腹水从1∶200开始，进行2倍倍比梯度稀释，CSFV用无血清培养基稀释至200 TCID50，然后将二者等比例混合，37 ℃孵育1 h；弃去PK15细胞板中的培养基，每孔加入100 μL的病毒和单克隆抗体腹水的孵育液，37 ℃孵育培养2 h，弃去细胞板中液体，加入含2%FBS的DMEM培养基，37 ℃继续培养20 h。弃去培养上清，用含有3%H2O2的甲醇固定液室温固定15 min。以1∶400稀释的SCFV阳性血清为一抗，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST洗6次；以1∶1 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，室温孵育30 min，PBST洗6次。AEC显色后用显微镜观察并记录结果，计算抗体中和滴度。

2 结果与分析

2.1 抗原纯化与鉴定

采用切向流超滤浓缩法和离子交换层析法纯化CSFV粒子，经IPMA检测，结果如图1A所示，纯化后CSFV滴度为106.5TCID50，未感染病毒的PK15细胞阴性对照组成立(图1B)。采用Ni柱亲和层析法分别纯化重组杆状病毒和重组大肠杆菌表达的CSFV E2蛋白，经SDS-PAGE分析估算，其重组CSFV E2蛋白的纯度均为95%左右(图1C、1D)。

A.IPMA检测纯化的CSFV；B.IPMA阴性对照；C.SDS-PAGE检测纯化的CSFV E2(杆状病毒来源)蛋白；D.SDS-PAGE检测纯化的CSFV E2蛋白(大肠杆菌来源)；M.蛋白质Marker；1.杆状病毒来源CSFV E2蛋白；2.大肠杆菌来源CSFV E2蛋白

2.2 小鼠抗体效价测定

将第3次免疫后14 d(即免疫后第56 天)的小鼠血清倍比稀释，间接ELISA检测结果显示，A、B 2组抗体效价最高均能达到5.12×104；商品化抗体检测试剂盒(IDEXX公司)检测结果显示，免疫后56 d，6只小鼠产生的抗体阻断率为72.6%～86.2%(表1)。由此可见，不同试验组的小鼠都产生了较高效价的抗CSFV特异性抗体，且具有一定的中和活性。

2.3 抗CSFV E2蛋白单克隆抗体的筛选

通过有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆，并结合IPMA方法筛选，共筛选到4株抗CSFV E2蛋白的单克隆抗体(5D1、8H7、9A1和13B2)，IPMA结果显示，4株单克隆抗体均能与CSFV发生特异性反应(图2)。

表1 ELISA检测免疫小鼠血清效价及抗体阻断率

A.5D1；B.8H7；C.9A1；D.13B2；E.WH303；F.阴性对照

2.4 单克隆抗体腹水效价测定

间接ELISA及IPMA方法检测4株单克隆抗体腹水的效价，结果如表2示，间接ELISA检测4株单克隆抗体的腹水效价在2.56×105～1.02×106；IPMA效价分别为：6.40×104、1.28×105、2.56×105、1.28×105。

表2 间接ELISA及IPMA测定单克隆抗体腹水效价

2.5 单克隆抗体的特异性鉴定

采用IPMA试验分别检测4株单克隆抗体与PCV2、BVDV和PRRSV的交叉反应情况，结果显示，4株单克隆抗体均能与CSFV发生特异性反应，而与PCV2、BVDV和PRRSV均不发生反应(图3)。Western blot鉴定结果显示，4株单克隆抗体均能与杆状病毒表达的CSFV E2蛋白发生特异性反应，在约46 ku处有1条明显的特异性反应条带(图4A)；同时，也能够与大肠杆菌表达的CSFV E2蛋白发生特异性反应(图4B)。以上结果表明，4株单克隆抗体均能特异性识别CSFV E2蛋白的线性表位。用Proteintech公司的单克隆抗体亚型鉴定试剂盒检测4株单克隆抗体的亚型，检测结果表明，4株单克隆抗体轻链都属于κ型，其中，5D1、8H7、13B2为IgG1亚型，9A1为IgG2c亚型。

图3 IPMA测定4株单克隆抗体的特异性

2.6 中和性单克隆抗体的筛选与鉴定

将CSFV SM株病毒液稀释至200 TCID50，分别与4株倍比稀释的单克隆抗体孵育，进行病毒中和试验。结果显示，1∶200稀释时，5D1、8H7、9A13株单克隆抗体有一定的中和活性，单克隆抗体13B2具有明显的中和活性，其中和效价能达到1.28×104，而PRRSV单克隆抗体腹水的阴性对照则完全没有中和作用(图5)。

A.重组杆状病毒表达的CSFV E2蛋白；B.重组大肠杆菌表达的CSFV E2蛋白；M.蛋白质Marker；1.CSFV E2蛋白的SDS-PAGE鉴定；2.5D1；3.8H7；4.9A1；5.13B2;

图5 4株单克隆抗体的中和抗体效价

3 结论与讨论

在CSFV 结构蛋白中，E2蛋白是主要的免疫抗原，可诱导机体产生特异性的中和抗体，是制备抗CSFV单克隆抗体的理想免疫原[9-11]，CSFV E2蛋白已在杆状病毒表达系统中成功表达[12-13]。国内外学者针对 CSFV E2 蛋白制备了一系列单克隆抗体，王爱华等[20]、许保疆等[21]分别用纯化后的CSFV作为免疫原，最终获得抗CSFV的单克隆抗体，但并未发现筛选到的单克隆抗体具有中和活性；夏照和等[25]以纯化的杆状病毒表达的重组HCLV-E2蛋白为耐受原、CSFV石门株E2蛋白为免疫原，采用环磷酰胺免疫抑制法制备特异性识别CSFV野毒株的单克隆抗体，获得了1株能稳定分泌抗E2蛋白单克隆抗体并具有中和活性的杂交瘤细胞株，但是中和效价较低。由于CSFV浮密度小，细胞培养病毒滴度不高，难以纯化，为CSFV单克隆抗体的制备带来了诸多难题，本研究采用经切向流超滤系统超滤浓缩以获得高滴度的CSFV，再经过Sepharose 4 Fast Flow过滤层析纯化进而获得纯度较高的CSFV，有效解决了因粗病毒免疫小鼠后产生许多针对细胞成分的抗体这一难题。此外，本研究采用CSFV粒子和重组表达E2蛋白作为抗原的免疫方案，为CSFV中和性单克隆抗体的制备提供了一种新的思路。经过阻断ELISA测定免疫小鼠效价，分别选择CSFV E2蛋白及纯化的CSFV免疫组中阻断效价最高的小鼠进行细胞融合，通过IPMA等方法筛选，获得了4株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经鉴定，4株单克隆抗体与杆状病毒表达系统及大肠杆菌表达系统获得的CSFV E2蛋白均能发生特异性反应，且与CSFV细胞毒具有良好的反应性和高度的特异性；其中1株单克隆抗体具有较高中和活性，中和效价为1.28×104。本研究成功获得了1株针对CSFV中和表位的特异性单克隆抗体，为进一步研制CSFV抗原快速检测产品提供技术支持，同时为CSFV中和表位鉴定以及病毒致病机制等方面的研究奠定基础。