基于液相色谱的镇江香醋及其相关产品中四甲基吡嗪的分析方法

纪凤娣，鲁 绯，陶汇源，穆晓婷，李 东，夏 蓉,*

（1.北京市营养源研究所，北京 100069；2.镇江恒顺生物工程有限公司，江苏 镇江 212000）

传统的中国醋，也叫谷物醋，是中国人日常生活中重要的调味料，有3 000多年的悠久历史。近十多年来，有报道称醋有多种生理作用，如调节血糖和血压、助消化、刺激食欲和促进钙的吸收[1]。中国有四大著名的中式谷物醋，分别为山西陈醋、镇江香醋、四川麸皮醋和福建红曲醋。其中，镇江香醋以糯米为原料，经固态发酵而成，以其独特的风味、悠久的生产历史、丰富的产量和独特的发酵工艺而备受推崇[2]。

四甲基吡嗪（又名川芎嗪）（2,3,5,6-tetramethylpyrazine，TMP），是中药川芎中一种重要的生物活性物质[3]。TMP具有药理作用，被认为是治疗心脑血管疾病的有效药物[4]。研究证明TMP也是醋等许多发酵食品和饮料中检测到的一种主要的吡嗪类化合物[4]，其主要由酿造过程中的微生物代谢和美拉德反应产生，是一种健康风味成分，这是食醋的保健作用的依据。此外，TMP具有类似于炒坚果和烤肉的怡人香气，香气透散性好，对其他香味有显著的烘托和叠加作用，通常也被认为是一种安全的物质，广泛应用于食品工业中，作为呈坚果味和烤面包口味的食品配料成分[5-6]。

由于TMP是在食醋发酵过程中形成的化合物，因此可作为发酵过程的一个重要指标，是优化整个食醋生产的有效参数之一。近年来，人们对TMP的研究，以及对其他挥发性组分的研究，传统上都是通过溶剂萃取[7-9]、蒸汽蒸馏[7-9]、超临界流体萃取[10]或顶空固相微萃取[7,9,11-13]以及随后的气相色谱[14-15]或气相色谱-质谱[9-13,16-18]分析进行。液相色谱法[19-23]和液相色谱-串联质谱法[24-27]在TMP的分析测定中也有应用，主要涉及中药川芎及其制品[17-21]、生物样品[20-22,24-27]和食品等[23,28-29]。相比液相色谱，在采用气相色谱的分析测定中，样品的前处理过程比较繁琐，重复性相对较差，因此，对TMP的分析采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）法，特别是超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）法具有一定的优势。

本研究建立测定镇江香醋及其相关产品中TMP含量的UPLC和HPLC分析方法，可以作为监控食醋生产过程和相关产品中TMP参数的技术手段和理论依据，对指导生产和消费具有积极的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

镇江香醋及相关产品由江苏恒顺醋业股份有限公司提供。

四甲基吡嗪（纯度≥98%） 北京索莱宝科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱级） 美国Fisher Chemical公司；三氟乙酸（色谱级） 天津市科密欧化学试剂有限公司；乙醇、乙酸（均为分析纯） 北京化工厂；氢氧化钠（分析纯） 西陇化工股份有限公司；实验所用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

Accucore Vanquish系列UPLC仪（含高压二元体系泵、自动进样器、二极管阵列检测器（diode-array detector，DAD）和Chromeleon 7.2 SR4色谱数据系统等）美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司；FE28 pH计瑞士Mettler Toledo公司；CF16RX高速冷冻离心机 日本Hitachi公司；KQ5200DE型数控超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司；MX-F涡旋混合器 北京联合科仪科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理及标准溶液配制

准确称取香醋等样品1 g，加水至5 mL，涡旋混匀后置于冰浴中冷却，用氢氧化钠固体颗粒调节其pH值为8.5左右，加入提取液（5%乙酸＋15%水＋80%乙醇）25 mL，混匀后在25～30 ℃水浴中超声提取30 min；10 000 r/min离心10 min，用滴管将上清液转移至50 mL容量瓶中，室温下用上述提取液定容至刻度，混匀后经0.22 µm微孔滤膜过滤，待用。

精密称取TMP标准品10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL作为储备液，于-20 ℃避光保存，临用前进行系列稀释。

1.3.2 色谱条件

UPLC条件：Accucore Vanquish C18＋色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.5 µm）；柱温40 ℃；检测波长297 nm；流动相：甲醇和pH值为2.4的酸溶液（含1%的乙酸和0.05%的三氟乙酸）（25∶75，V/V）；流速0.3 mL/min；进样体积5 µL。根据保留时间（配合紫外光谱）定性化合物，使用外标法根据峰面积定量。

H P L C条件：Z O R B A X S B-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；柱温40 ℃；检测波长297 nm；流动相：甲醇和pH值为2.4的酸溶液（含1%乙酸和0.05%三氟乙酸）（25∶75，V/V）；流速0.8 mL/min；进样体积5 µL。根据保留时间（配合紫外光谱）定性化合物，使用外标法根据峰面积定量。

1.3.3 标准曲线的绘制

移取一定量的TMP标准储备溶液，用甲醇稀释配制质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 µg/mL和50 µg/mL的TMP系列标准溶液。按照1.3.2节色谱条件进行分析，以TMP的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，进行线性回归分析。相关系数R2大于0.999时进行样品定量分析。

1.3.4 加标样品回收率的测定

准确称取1 g不含TMP的白醋样品18 份，1～6号样品加入100 µg的TMP，7～12号样品加入200 µg的TMP，13～18号样品加入1 000 µg的TMP，按照1.3.1节方法进行样品的预处理，再按照1.3.2节色谱条件进行测定，计算回收率。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

如图1所示，随着混合溶剂中甲醇含量的减小和酸性溶液的增加，溶液pH值降低，TMP的最大吸收波长由282.32 nm和294.17 nm红移至301.39 nm，而在乙腈和酸性溶液混合溶剂中，TMP在波长300 nm左右有一个最大吸收峰。Li Junbo等[30]报道在pH 1.5的HCl介质中，TMP与12-钨磷酸形成物质的量比为3∶1的离子缔合物，导致双波长共振瑞利散射、二级散射和倍频散射光谱显著增强，并形成新的散射光谱。因此，推断在不同pH值的酸性溶液中，TMP与酸性物质的作用不同导致分子光谱的差异。结合参考文献比较TMP在波长300、297[23]、295 nm[28]和278 nm[29]等几个不同波长的色谱响应，选择采用297 nm作为检测波长。

图1 不同溶剂中TMP的紫外-可见光谱图Fig. 1 Ultraviolet-visible spectra of tetramethylpyrazine in different solvents

2.2 流动相和色谱柱的选择

考察不同流动相、pH值和流动相配比对TMP色谱行为的影响，同时对在UPLC法和在HPLC法中使用的色谱柱进行选择。比较甲醇和水流动相、乙腈和水流动相、甲醇和乙酸溶液流动相、乙腈和乙酸溶液流动相以及甲醇＋乙酸和三氟乙酸溶液对实际样品的分离效果，选择甲醇＋乙酸和三氟乙酸溶液作为流动相，通过优化两相配比和调节pH值，确定以25%甲醇和75%酸性溶液（pH 2.4，含1%乙酸和0.05%三氟乙酸）作为流动相。

比较UPLC法中，TMP在Accucore Vanquish C18＋色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.5 µm）和ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 µm）分析柱上的色谱行为，考察2 种分离柱对实际样品的分离效果，选择Accucore Vanquish C18＋色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.5 µm）作为UPLC法测定TMP的分离柱。

比较HPLC法中，TMP在ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）和Hypersil GOLD C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）的色谱行为，考察2 种分离柱对实际样品的分离效果，选择ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）作为HPLC法测定TMP的分离柱。

2.3 提取方法的选择

镇江香醋中除了较高含量的乙酸外，还含有丙酸、丁酸等短链脂肪酸以及没食子酸、阿魏酸、咖啡酰奎宁酸、原儿茶酸和香草酸等酚酸类化合物[31-32]。TMP是一个含有1,4-二氮杂苯母环的化合物，分子结构中有2 个电负性较大的N元素。推断在酸性条件下，TMP在香醋样品中可以和这些酸性或酚酸化合物通过超分子作用力如氢键形成不规则的聚集物或者缔合物。因此，在提取香醋中TMP时使其游离出来，再以酸性溶剂提取会提高提取效率。实验考察不同pH值条件下的提取效率，考察色谱峰峰面积与取样量的比值，结果表明提取效果在样品的pH 8.5～8.8时较好，考察酸性提取液（5%乙酸＋15%水＋80%乙醇）和提取液（20%水＋80%乙醇）对TMP的提取效果，最终选择在样品pH值为8.5条件下，以体积比为5∶15∶80的乙酸-水-乙醇作为提取液。

考察超声提取时间对提取效率的影响，平行称取同一样品3 份，按照上述方法处理后再分别超声处理20、30 min和40 min，计算峰面积与取样量的比值，结果表明超声提取时间为30 min和40 min的提取效果无显著差异，而超声提取时间为20 min的提取效果稍差。根据实验结果，选择超声处理时间为30 min。

2.4 标准曲线的线性范围和精密度结果

图2 TMP标准溶液色谱图Fig. 2 UPLC and HPLC chromatograms of TMP standard solution

分别将不同质量浓度的TMP标准溶液按UPLC和HPLC色谱条件进行测定，如图2所示。UPLC法分离TMP的保留时间为1.6 min左右，HPLC法分离TMP的保留时间为9.7 min左右。由表1可知，TMP质量浓度与峰面积具有良好的相关性。以10 μg/mL的TMP标准溶液连续重复进样8 次进行精密度实验，TMP测定结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），分别为0.018%（UPLC法）和0.035%（HPLC法），均小于3%，表明精密度满足方法学定量的要求。

表1 TMP的标准曲线线性范围Table 1 Linear ranges of standard curves of UPLC and HPLC for TMP

2.5 方法的准确度和重复性实验结果

选择不含TMP的白醋样品进行加标回收实验。在上述优化后的实验条件下，分别对100、200 μg和1 000 μg添加水平的样品进行测定，结果如表2、图3所示。平均回收率在87.9%以上。

表2 回收率实验结果Table 2 Results of recovery tests

图3 白醋样品和加标样品色谱图Fig. 3 UPLC and HPLC chromatograms of unspiked and spiked samples

2.6 方法的检出限和定量限结果

根据GB/T 27417—2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》对检出限和定量限的规定，以3 倍的信噪比确定方法的检出限，以10 倍的信噪比确定方法的定量限。UPLC法测定TMP的检出限为0.000 3 g/kg，定量限为0.001 g/kg，HPLC法测定TMP的检出限为0.008 g/kg，定量限为0.025 g/kg。结果证明，相比HPLC法，UPLC法具有更高的检测灵敏度。

2.7 样品中TMP的含量测定结果

镇江香醋、镇江陈醋和醋粉中TPM含量分别为0.147、0.294 g/kg和0.250 g/kg，而白醋中不含TMP，结果如表3、图4所示。

表3 样品中TMP含量Table 3 TMP contents in real samples

图4 镇江香醋样品的色谱图Fig. 4 UPLC and HPLC chromatograms of Zhenjiang vinegar sample

3 结 论

建立适用于食醋中TMP的分析方法对于食醋及其相关产品的质量控制和市场监管是极其重要的。本研究建立测定镇江香醋及其相关产品中TMP含量测定的UPLC法和HPLC法。采用酸性乙醇溶液提取TMP，采用C18色谱柱分离，柱温40 ℃，以25%甲醇和75%酸性溶液（pH 2.4，含1%乙酸和0.05%三氟乙酸）作为流动相，在UPLC法中流动相流速0.3 mL/min，在HPLC法中流动相流速0.8 mL/min，紫外检测器297 nm进行检测，2 种方法重复测定结果的RSD均小于3%，回收率在87.9%以上，UPLC法TMP的检出限为0.000 3 g/kg，定量限为0.001 g/kg，HPLC法TMP的检出限为0.008 g/kg，定量限为0.025 g/kg。方法学验证结果表明，2 种分析方法准确性好，均适用于食醋及其相关制品中TMP的含量测定。UPLC法的灵敏度高，分析速度快，HPLC法适用范围更广泛，可以作为有效控制食醋及相关产品质量的依据，具有一定的理论意义和应用价值。